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1、一. 分批发酵 (batch fermentation) 1. 分批发酵概况操作工艺 2. 分批发酵中的菌体生长规律、代谢变化 3. 分批发酵过程的最优化、生产率 二. 补料分批发酵（Fed-batch Fermentation） 1补料分批发酵技术含义及二者区别 2补料分批发酵技术特点和类型： 3补料分批发酵的适用范围 4. 流加物料的方式和补料分批发酵的技术评价 三 高密度发酵（High cell-density fermentation） 1. 高密度发酵的定义、生产影响因素、策略以及反应器： 2. 重组大肠杆菌高密度发酵、 3. 除去抑制物的方法和存在的问题,第七章 分批发酵、补料分批
2、发酵和高密度发酵,分批发酵是指生物反应器的间歇操作, 在发酵过程中,除了不断进行通气(好氧发酵)和为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外, 与外界没有其它物料交换。这种培养方式操作简单, 是一种最为广泛使用的方式。分批发酵的主要特征是所有工艺变量都随时间而变化。主要的工艺变量是各种物质的浓度及其变化速率。(见下表),微生物工艺中的变量及其变化速率,rx,分批发酵的思考 在分批发酵中, 低浓度培养基中的营养物会迅速耗尽, 引起培养物过早地从指数生长期向稳定期转变。 提高底物浓度的优点与不足: a. 提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期, 从而提高发酵的容量产率和产物浓度 。 b. 提高底物浓度(对
3、于某些可溶性碳源来说, 微生物的 Ks 值多在1- 10mg/ L范围内,当超过10 Ks或 10 -100mg / L时,微生物就会以接近最大比生长速率 (max )的速度生长) c. 过高的底物浓度会造成一系列不利影响, 底物抑制, 培养基粘度升高引起传质效率降低等。克服 此不足的方法就是采用Fed-Batch法(补料分批技术),一. 分批发酵 1. 分批操作工艺 分批发酵目的产物种类虽然不同, 但操作工艺基本相同. (见下图),典型的分批发酵工艺流程图,1) 主要设备 主培养罐 (主发酵罐) 和种子培养罐(种子罐), 均属于深层培养装置。(含有配料, 蒸气灭菌, 冷却, 通气, 空气过虑
4、, 搅拌和消泡装置等)。种子罐: 为主发酵罐培养基接种所需要的菌体种子。 摇瓶培养 - 种子培养 - 发酵培养 (10倍体积逐级扩大) 2) 发酵生产基本过程 种子罐高压蒸气灭菌(空消) - 投入培养基再灭菌(实消) -接入从摇瓶培养得来的种子 -培养。 同时, 准备发酵罐 - 空消- 连消: 利用专门的灭菌装置对发酵培养基进行连续灭菌-投入空消过的发酵罐。经培养种子罐内达到一定菌体量时-发酵罐 - 发酵终点 - 提取精制。 发酵周期: 每批反应的全过程即加入灭菌的培养基, 接种, 培养的诱导期, 反应过程, 放罐, 洗罐以及空罐灭菌所需要时间的总合。,2. 分批发酵中的菌体生长规律 微生物的
5、生长包含两个含义 即：细胞的生长 微生物群体数量的增加 1) 典型的生长周期 分批培养是一个封闭的系统。接种后, 除氧之外, 一般都不向系统内添加和除去任何物质。因此, 分批培养系统只能在一段时间内支持微生物的增殖。可以分为五个时期: A 延迟期 B 对数生长期 C 减速期 D 静止期 E 衰退期,分批发酵中细胞浓度的变化 延迟期；2. 对数生长期；3. 减速期； 4. 稳定期；5. 衰退期, 延迟期或延滞期 发酵培养基在接种后，一段时间内细胞浓度的增加不明显，该阶段为延迟期。新环境中存在某些旧环境中没有的营养物质，细胞须合成有关酶类来利用该营养物质，从而出现延迟期。许多胞内酶需要辅酶或活化剂
6、，它们是一些小分子物质或离子，具有较大的通过细胞膜的能力。当细胞转移到新环境中，这些物质可因扩散作用而从细胞中向外流失，这是产生延迟期的又一原因。 如：产气气杆菌在葡萄糖磷酸缓冲液中的延迟期与镁离子浓度有关，当培养基中镁离子浓度较高时，细胞内镁的流失少，延迟期较短；而当培养基中镁离子浓度低时，由于镁的流失而使延迟期大大延长。 延迟期的长短与种子的菌龄及接种量的大小有关。年轻的种子产生的延迟期较短，接种量愈大，则延迟期愈短，生产实践中缩短延迟期的方法主要有：加大接种量；在新的培养基中加入上次培养基的某些成分。, 对数生长期 延迟期末，由于培养基中的营养物质比较充足，目标产物尚未开始积累或积累的很
7、少，有害代谢物亦很少，所以细胞的生长不受到限制，细胞浓度随培养时间呈对数增长，称为对数生长期，也称为指数生长期。 初始接种量越大，即：培养液中的细胞浓度愈大，细胞浓度的增长速率也就愈大。所以，菌体细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比：,如在 t1 时的菌体细胞浓度为X1，则在 t2 时的细胞浓度为： X2 =X1 expm(t2 t1) 所以，在对数生长期，细胞浓度随时间指数增长，细胞浓度增长一倍所需的时间称为倍增时间 (doub1ing time，td)。根据式上式可得倍增时间的计算公式：,比生长速率与细胞种类、培养温度、pH、培养基组成成分和限制性基质浓度等因素有关。在对数生长期内，细胞的生长
8、不受限制，比生长速率达到最大值m，,微生物细胞的倍增时间较短。细菌一般为0.251小时，酵母菌约为1.152小时，霉菌约为26.9小时。动植物细胞的倍增时间较长，如哺乳动物细胞的td一般为15100小时，植物细胞约为2474小时。, 减速期 随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，目的产物开始大量积累的同时，有害代谢物亦逐渐积累，细胞的生长速率逐渐下降，进入减速期。当培养液中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质浓度S的关系可用Monod方程来表示：,当限制性基质浓度很低时，增加该基质浓度可明显提高细胞的比生长速率，但若该基质浓度与Ks相比已相当高时，再增大其浓度就不
9、能明显地增加细胞的比生长速率。这时，细胞的比生长速率接近“饱和”。 在培养动植物细胞和微生物细胞生产代谢产物时，产物的最大生产速率往往是在生长受到抑制的情况下得到的。采用适当的限制性基质限制细胞生长，有时会有利于产物的积累。如：酵母菌Y33:YFD71-3是一株腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸缺陷的基因工程菌. 在进行摇瓶培养时，菌体生长受腺嘌呤限制时菌体分泌的蛋白明显增加，而菌体生长受亮氨酸限制时，蛋白的生产受到影响。如下表所示。这是因为生长受到腺嘌呤的限制时，过量存在的氨基酸可用于蛋白质合成，而生长受亮氨酸限制时，蛋白质的合成也受到了限制。,腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸对酵母菌（Y33:YFD71-3）生
10、长和蛋白质合成的影响,方程进一步变换形式后即为： X = Xme-t 式中Xm为静止期细胞浓度，g/L； 为细胞比死亡速率，s-1；t 为进入衰亡期时间，s。, 稳定期或静止期 由于营养物质耗尽或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增加，这一阶段称为稳定期或静止期。在稳定期细胞的浓度达到最大值。如果这是由某种营养基质的耗尽所致，而且在细胞的生长过程中细胞的得率系数Yx/s不变，那么，在稳定期达到的最大细胞浓度为： Xm = X0 + Y x/s S0 式中 Xm 为最大细胞浓度；X0为接种后的细胞浓度；S0为限制性基质的初始浓度。所以，Xm与限制性基质的初始浓度成线性关系，当X0很低时X0与S0
11、成正比。 哀亡期 由于环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度不断下降，这一阶段称为衰亡期。有关衰亡期的研究不多，因多数分批培养在衰亡期前就结束了。可以认为在衰亡期中：,2）多底物培养基上的生长 当微生物在含有两种碳源的培养基中生长时，往往会出现二峰生长现象，表现出两段生长时期。在实际工业发酵中，许多常用的复合培养基都含有多种碳源或含有成分复杂的营养物（如麸皮、豆饼粉）。在这样的培养基中，微生物的生长会经历连续的变化，难以区分开其中的各个生长时期。每一时期都伴随着相继的 生长速率的降低。在生长过程中，随着时间的进程，生长的斜率（）逐渐降低，看不出明显的指数生长期。,复合培养基中微生物生长速率相继降低
12、的生长动力学曲线,微生物菌种有时会表现出线性生长（linear growth）特征，即：菌体生长的速度为一常数。表现为： dX/dtC。此时，线性生长与菌体量无关。出现线性生长的原因很多，主要是存在限制性的因素。如：酶浓度低而只表现恒定的活性，营养物质缺乏，外部或内部的传质限制等。由供氧不足引起的线性生长是外部传质限制的典型例子。增加体积氧传递系数(KL)就可以消除线性生长,在分批培养中，氧传递系数降低影响微生物生长 提高体积氧传递系数可使微生物由线性生长（1）转变为指数生长（2）,3.分批发酵过程中的代谢变化 （1）菌体生长阶段 发酵前期或菌体生长期。发酵培养基接种后，产生菌经过延迟期，开始
13、发育、生长和繁殖。直至达到菌体的临界浓度。此阶段的代谢变化，主要是碳、氮源的分解代谢以及菌体细胞物质的合成代谢，二者有机地联系在一起。营养物质不断被消耗，新菌体不断合成，溶解氧水平不断下降。当营养消耗至一定程度，菌体生长速率减慢；出现与产物合成有关的新酶等原因，转入产物合成阶段。 （2）产物合成阶段 发酵中期或产物分泌期。此期以合成产物为主，产物生成速率达到最大，并一直维持到合成能力衰退。此阶段，菌体重量有所增加，但呼吸强度一般无显著变化。代谢变化以碳、氮源的分解代谢和产物合成代谢为主，二者有机地联系在一起，营养物质不断消耗，产物不断合成。此外，尚有合成菌体细胞物质的代谢存在，但不是主要的。
14、一般在这个阶段必须将营养物质的浓度控制在一定范围内，如果营养过少，则菌体易衰老，合成代谢能力衰退，对生产不利。此外，发酵液的pH、温度和溶氧浓度都会影响发酵过程中的代谢变化，从而影响产量，必须予以严格控制。,（3）菌体自溶阶段 发酵后期或菌体自溶期。此阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成产物的能力衰退，生产速率下降，NH2-N增加，pH上升。此时发酵必须结束，否则会使产物受到破坏，还会给发酵液过滤和提炼带来困难。 代谢曲线能够清楚地表明发酵过程中的代谢变化，并反映C、N的利用和pH、菌体重量及产物浓度等参数之间的关系。对代谢曲线进行分析研究，有利于掌握代谢变化的规律及发现工艺控制中存在的问题，有助
15、于改进工艺。,解淀粉芽孢杆菌LL330 L发酵体系生产-PGA,图 红霉素发酵前期OUR、CER 及R Q 趋势曲线图,相关参数：摄氧率( OUR)、二氧化碳释放率(CER )、呼吸商( RQ)、氧传递系数( K La),4. 分批发酵过程的最优化 分批发酵的最优目的: 以最小的费用获得最大产量。 生产成本: 原料费 + 操作费(通气费+搅拌费) 最优化的目标函数: 可以取产量(对反应器而言, 就是最终产物浓度 P, 生产率(单位时间的平均产量 PiV / ti ), 纯利润等。也可用其中的两个进行多目标函数优化。,1）培养基配方的最优化 有必要研究所用培养基的各组分含量是否必要或是否充分利用了。在分批培养中，所有的培养基组分一次投入，不在中途调节和控制其浓度，因而底物浓度一直下降，变化幅度很大。无论rx、rs、rp等速率参数在反应中与底物浓度有怎样的对应关系，仅根据化学计量关系确定营养物的初始浓度，也是比较合理的。即预先设定Xst为最大菌体浓度，则可得底物Si的初始浓度为： 无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收，在细胞内保持原化学状态，且含量恒定不变。这类营养物质称为储存性底物。可根据这些物质在菌体内的实际含量，同类似于上式的方法确定其需要量。 代谢产物的产量与培养基配方之间的关系很复杂，不能用解析函数形式表示时，可采用实验设计法确定最优初始浓度。实
