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1、1,细胞免疫荧光技术,2,实验目的,掌握免疫荧光技术的基本原理 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果,3,实验原理,原位检测 抗原抗体特异反应 间接法,间接荧光抗体染色法示意图,Hela细胞,Vinculin,4,实验用品,试剂： 固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4,材料： Hela细胞 细胞培养皿 仪器： 荧光显微镜,5,实验步骤,一，细胞
2、制备和细胞固定,6,实验步骤,二，细胞免疫荧光ICC染色,0.2% TritonX 处理5min,封闭 室温30min,4过夜,371-2小时,375-10min,荧光显微镜观察,7,实验结果,三，观察,human HeLa cells,8,实验中应注意的问题,细胞不要铺的过密:60-70% 防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗,9,1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术,标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质,免疫细胞化学技术,10,免疫细胞化学技术注意事项,选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对照实验,11,思考题,检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？,12,疑难解答,一，缺乏染色,13,二，高背景,14,15,三，细胞/组织的形态被破坏,16,17,四，染色不正确,
