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1、1,原位杂交操作流程,2,冰冻切片的（DIG-labeled RNA probe）原位杂交操作程序 一、 切片制备 用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，37干燥14小时，进行下一步操作。 二、 预杂交前处理 预固定：4%PFA（in DEPC-PBS Ph7.4）RT 3060min 4%PFA：多聚甲醛 20g 1PBS 450ml 加热（60、20min）溶解 冷却后调pH至7.4 1PBS 500ml PBS RT 5 min2 10PBS：500ml NaCl 40g KCl 1g KH2PO4 1g Na2HPO4 7.7g DEPC水 450ml 调Ph至7.5 DEPC水加至500ml
2、 PBS(含0.3%v/vTritonX-100) RT 15 min 临用前配制 10%TritonX-100 15ml 1PBS 500ml PBS RT 5min 2,3,消化： 2g/mlProteinase K in TE buffer 37 10 min TE： pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml pH8.0 EDTA 0.5M 1ml DEPC水 500ml 0.2%Glycin in PBS RT 5 min2 (50 xDenharts; Ficoll 400 聚蔗糖 1g 后固定：4%PFA in PBS RT 15 min PVP 聚乙烯基吡咯烷酮 1g BSA
3、牛血清白蛋白 1g DEPC 水 100ml） PBS RT 3 min2 0.1M 三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐 RT 5 min2 0.1M 三乙醇胺：三乙醇胺 2.64ml DEPC水 200ml 用前加入乙酸酐 500l PBS RT 5 min2,4,三、 预杂交 预杂交 50 2h 预杂交液： 50%去离子甲酰胺 5SSC 5Denhardts 0.02%SDS 0.1mg/mltRNA 四、 杂交 杂交 50 12h以上,5,五、 杂交后处理 2SSC脱去盖膜（片） 50 2SSC清洗 37 10 min2 20g/mlRNaseA in Rnsae buffer 37
4、30 min Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W 1000ml Rnase buffer 37 30 min 2SSC 50 15 min2 1SSC（含0.02%SDS）37 15 min2 5%SDS 2ml 1SSC 500ml 0.1SSC 37 15 min2,6,Buffer 37 10 min2 Buffer: 2M Tris-HCl Ph7.6 25ml 3M NaCl 25ml D.W. 500ml 封闭；0.5%抗体阻断液 in Buffer（含0.2%Tween20） 37 20 mi
5、n 抗体阻断液 : (1:500抗地高辛抗体 in 阻断液 37 2 h) 阻断剂 1g Tween-20 0.4ml Buffer 37 10 min2 Buffer 200ml Buffer 37 10 min2,7,显色； Buffer: 2M Tris 10ml （1:50NBT/BCIP Stock Solution in Buffer 224h） 3M NaCl 6.67ml MgCl2 2.033g （湿合、避光） D.W. 180ml 浓HCl调pH至9.5 D.W. 200ml 终止反应： Buffer RT 5min2 流水冲洗 5-10min 1%甲基绿复染3-10min
6、， 水洗，晾干，封固,8,DNA探针检测石蜡切片中DNA,9,组织标本,肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。,10,试剂,120SSC 2HBV cDNA-Dig探针 5g 34多聚甲醛 40.1mol/L PBS，pH7.4 50.2mmol/L HCl 和0.1mol/L甘氨酸 PBS pH7.4 60.4 Tritor X-100 PBS pH7.4 7蛋白酶 20g/ml 80.25乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制 9预杂交缓冲液和杂交缓冲液 10. AKP标记抗Dig Fab段二抗，可1:500稀释 11. TSM、TSM
7、2（配制参阅附录4） 12. NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit,11,操作流程,杂交前处理 预杂交 杂交 杂交后漂洗 杂交后检测 结果判断,12,杂交前处理,1. 石蜡切片常规脱蜡至水 2. 0.02M pH7.4 PBS洗33min 3. 0.2M HCI 20min 室温 （除去蛋白） 4. 2SSC（内含5M EDTA） 50 洗 30min 5. 蛋白酶 2g/ml 37 20min 6. 0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室温，中止酶反应 7. 4多聚甲醛，20min 室温 8. PBS洗 33min 9. 75，85，95和无水乙醇各2min,13,预杂交和杂交,加预杂
8、交液 20l/每片，42 2h。 加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNA Dig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95 10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。,14,杂交后漂洗,1. 将切片置于2SSC液内振动移去盖片 2. 2SSC洗 210min， 55 3. 0.5SSC 25min， 50 4. PBS洗33min 5. 10醋酸 20min 室温，阻断内源性碱性磷酸酶 6. PBS洗33min,15,信号放大和显示,1. 1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37
9、4h，或4过夜 2. PBS洗 33min 3. TSM1洗 25min 4. TSM2洗 25min 5.显色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l， BCIP 混合后，显色30min12h，中间不断观察 6. TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染 7. 蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片,16,结果判断,17,ISH流程,探针合成 组织细胞标本的准备 ISH试剂的配制 操作流程,18,探 针,1、根据文献报道合成PCR引物一对。 2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶 进行PCR扩增。,19,3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACC
10、 I酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lac Z -肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。,20,4、 利用Roche生产的体外转录标记RNA kit（Cat.No 999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。,21,组织细胞标本的准备 ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）,
11、22,操作流程,1 1、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。 2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。 3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片98 10min，细胞片不用。 4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。 5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min. 6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。,23,7、预杂交 0.2SSC50甲酰胺 30min 37。 8、杂交：滴加杂交液（2g/ml） 加一层复盖膜，48杂交8-12h。 9、杂交后洗： 2SSC洗 25min 45 1SSC洗 25min 室温 0.5SSC洗 25min 室温 0.1SSC洗 25min 室温 PBS洗 33min,24,10、用10正常血清封闭 30min 11、抗Dig IgG 1:500 37 1h 12、PBS洗 33min 13、0.02M TBS pH9.015min 14、NBT/BCIP显色 1h-24h 15、洗后，核固红衬染，蒸馏水洗，脱 水，透明，封片。 16、结果观察：紫蓝色为阳性信号，红 色为背景。,
