动物细胞工程918751228精编版

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1、1、植物细胞工程常用的技术有哪些？,2、植物组织培养的过程？,3、植物组织培养的理论基础？,4、植物体细胞杂交的过程和理论基础？,复习：,动物细胞工程,专题2 细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,生产单克隆抗体,动物细胞核移植,动物细胞工程常用技术,动物细胞培养是其他细胞工程技术的基础,思考与回忆： 1.动物细胞全能性特点？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。 2.能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？ 不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时

2、间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。,动物细胞培养和,本节内容：,一、动物细胞培养,情境：在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对一个大面积烧伤的病人来说，自身健康皮肤有限，使用他人皮肤来源不同，而且会产生排异反应。那么，怎样能获得大量的自体健康皮肤呢？,1.动物细胞培养的概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,思考： 动物细胞培养的目的是什么？与植物组织培养目的相同吗？,动物的细胞培养的理论依据（原理）？,细胞增殖,2.动物细胞培养的原理：细胞增殖,定

3、义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。,原代培养,3：过程,图示,原代 培养,细胞悬液,CO2培养箱,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养

4、液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）,传代培养,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,3.总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,剪碎用胰蛋白酶处理,10代细胞,转入培养瓶,40-50代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液稀释,传代10代以内，遗传物质

5、不改变，保持正常二倍体核型。,传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）,为什么用胰蛋白酶处理？,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。,原代培养,4.动物细胞培养的条件:,1）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。 适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4,液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。,4）气体环境：,2）营养：,3）温度和pH：,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。

6、氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。,对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,主要有： 营养物质（糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子） 动物血清（10%20%）等,培养液（液体培养基）的成分,血清 如：小牛血清等 血浆 如：鸡血浆等 组织浸出液 可用鸡胚胎浸出液, 水解乳蛋白 由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末,一般可配制成0.5%溶液。,天然培养基,小资料,根据细胞的生理生化代谢特点,人工配制而成,为细胞提供一个近似体内生存环境,又便于控制和标准化操作 基本成分 各种碳水化合物(糖)、氨基酸

7、、维生素、无机盐、生长因子、激素等 常用培养液 几十种,人工合成培养基,小资料,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1：为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2:为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰 蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃

8、蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,问题6:动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7:动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题8:动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题9:目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？,10代

9、以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,5.动物细胞培养技术的应用:,1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞 3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物,植物组织培养和动物细胞培养的比较：,去 核,注 核,重组细胞,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、概念： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,2、原理： 动物细胞核具有全能性,比较以下细胞的全能性： 受精卵、二分裂球的子细胞

10、囊胚细胞、多能造血干细胞 单能造血干细胞、 水螅的消化细胞、人的消化细胞,细胞具有全能性,多能细胞,单能细胞,高度分化的体细胞,3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,4、体细胞核移植过程-示动物克隆-无性繁殖,1.）克隆羊多利培育过程：,细胞核移植,电脉冲刺激,胚胎移植,另一头绵羊的子宫,妊娠、出生,特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！因为： 一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞. 二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受

11、体,代孕 受体,1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示： b表示:,2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：,体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。,4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为,核移植,胚胎移植,白色,多利全部的核基因都来自白面绵羊,aa,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法： 激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶

12、牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,核移植流程:,1、供体细胞的采集与培养,5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。,6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。,4、将供体细胞注入去核卵母细胞,3、显微操作去除卵母细胞中的核,2、受体卵母细胞的采集与体外培养,7、胚胎移植入代孕母牛体内,8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。,胚胎分割：,受精卵,二等分,四等分,把每等份分别移植到母体子宫内，迅速繁殖出大批性状相似的个体。,动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活

13、动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。 分化的细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。 胚胎细胞克隆比高度分化的体细胞克隆要容易得多。,动物难以克隆的原因,5.体细胞核移植技术的应用前景,6.体细胞核移植技术存在的问题,看书P49-50页,定义： 指用自然或人工方法，使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。,三、动物细胞融合,动物细胞融合,诱导融合的因素： 生物法：灭活的仙台病毒诱导融合。 利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白

14、可能还有促进细胞融合的功能。 化学法：聚乙二醇诱导融合 因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。 物理法：离心、振动、电刺激,动物细胞融合技术的应用,遗传学上：基因定位 由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物（蛋白质）减少的对应关系，可以进行基因定位。 例如：人-鼠杂交细胞通常丢失人的染色体，可以进行人类基因的定位（如由于1号染色体丢失导致尿苷单磷酸激酶活性丧失，可知该基因位于1号染色体上） 免疫学上：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,植物、动物细胞融合的比较,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性,去除细胞壁后诱 导原生质体融合,使细胞

15、分散后 诱导细胞融合,物理（离心、振 动、电刺激） 化学（聚乙二醇）,物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒,获得杂种植株,主要用于制备 单克隆抗体,回忆：,1、抗体的化学本质？,球蛋白,2、抗体是由何种细胞产生的？,效应B细胞,3、抗体主要分布在哪？,血清,4、抗原的特异性取决于什么？,抗原决定簇,5、抗原决定簇的种类和数目是否相同？,不同,动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备,一种抗原只能与相应的抗体发生特异性结合。,6、抗原与抗体的关系？,一个抗原可以与多个抗体特异结合,4,脾脏,4种效应B细胞,B1,B2,B3,B4,抗原,B1,B2,B3,B4,Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,4种

16、特异性抗体,问题情境1： 长期以来，人们为了获得抗体，采用的就是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。 你认为这种做法有什么弊端？ 产量低，而且机体会产生多种抗体，抗体纯度低，反应不够灵敏，这种情况给临床医学的诊断与治疗带来诸多不便。,问题情境2：,每个浆细胞只分泌一种特异性抗体，要想获得大量专一性抗体，你能利用前面学习过的动物细胞工程的有关技术来解决问题吗？,（1）用单个特定B淋巴细胞进行无性繁殖，形成大量的细胞群体，即克隆。,（2）如此克隆出的B淋巴细胞遗传特性高度一致，由它们分泌的抗体化学性质单一、特异性强，叫做单克隆抗体。,质疑：,（动物细胞培养）,在体外培养条件下，一个B淋巴细胞可能无限增殖吗？,那么怎样才能获得大量单克隆抗体呢？,科勒,米尔斯坦,1