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1、2010年版微生物限度检查法 增修订内容简介,以中国药典一部为例 2008.10,一、增加的内容,1、增加了贴剂 的微生物检查方法 检查方法： 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。贴膏剂应采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。,2、增加了计数培养基的适用性检查,细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培
2、养基均应检查。,2、增加了计数培养基的适用性检查,结果判定 ：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。,3、增加了菌液使用时间的有关规定,菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。,4、删除了离心沉淀集菌法,原因：由三个所组成的课题组进行了离心沉淀集菌法 的标准化研究，结果表明：离心沉淀集菌法 对试验菌的损伤较大。,5、增加了常见干扰物的中和剂或灭活方法,微生物限度检查法.pdf,6、增加了没
3、有办法消除供试品中的抑菌作用 的情况及相关规定,若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。,6、增加了没有办法消除供试品中的抑菌作用 的情况及相关规定,计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回收
4、率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。,7、细菌、霉菌及酵母菌计数检查增加了阳性对照,阳性对照 除另有规定外，抗真菌供试品以白色念珠菌为对照菌，其它供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌，按供试品的细菌（霉菌和酵母菌）计数方法，测定试验菌在该供试品中的回收率。回收率应不小于70。否则实验结果无效，应重新确定计数方法。,8、增加了薄膜过滤法每张滤膜冲洗量的规定,每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml 滤膜直径一般为50mm，若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。,9、增加了选择滤膜材质的原则,选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微
5、生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。,10、增加了控制菌检查用培养基的适用性检查,控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。 微生物限度检查法.pdf,10、增加了控制菌检查用培养基的适用性检查,增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌（见表
6、2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。,10、增加了控制菌检查用培养基的适用性检查,固体培养基促生长能力检查：取试验菌各0.1ml（50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板中，每种培养基平行制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，计数。被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比应不小于70%，且生长的菌落形态应一致。,10、增加了控制菌检查用培养基的适用性检查,培养基抑制能力检查：划线接种试验菌（见表2）于被检培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下
7、培养，试验菌应不得生长。,10、增加了控制菌检查用培养基的适用性检查,培养基指示能力检查：分别接种少量试验菌（见表2）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培,11、增加了白色念珠菌控制菌检查,主要针对妇女阴道用药，为保证其安全性而增加。 检查法：取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养2448 小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。,11、增加了白色念珠菌控制菌检查,白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长
8、的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。,11、增加了白色念珠菌控制菌检查,芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上
9、的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置3537、13h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。 若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。,二、修订内容,1、修订了控制菌培养温度 控制菌培养温度由3537修订为3035。 此项修订不妥，原因：2010版控制菌增加了白色念珠菌，此菌为酵母菌，培养温度为2328。,2、删除了控制菌检查验证方法中阴性菌对照组试验,试验表明：阴性菌对照组实践意义不大,3、修订了菌数报告规则,细菌、酵母菌宜选取细菌、酵母菌平均菌落数（在30300之间）小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数
10、（在30100之间）小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的菌数。 微生物限度检查法.pdf,4、修订了菌落培养和计数时间,培养和计数 除另有规定外，细菌培养48小时3天，逐日点计菌落数，一般以48小时3天的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时5天，逐日点计菌落数，一般以72小时5天的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至57天进行菌落计数并报告。,5、删除了庖肉培养基,增加：梭菌增菌培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基(CHROMAGAR) 玉米-吐温80琼脂培养基,6、微生物限度标准修订内容,6.1含豆豉、神曲等发酵成分的制剂修订为含豆豉、神曲等发酵成分的原药材制剂 6.2菌落数由个修订为cfu，更加科学。 Cfu含义:colony formine unit,菌落形成单位（菌落数） 例如：细菌数 每1g不得过1000（个）cfu。每1ml不得过100（个）cfu。 6.3阴道、尿道给药制剂 增加了白色念珠菌检查,7,特殊品种可以最小包装单位报告。,
