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1、第 引, 卷 第期 刀卜年月 精 细 与 专 用 化 学 品 之。 一一吸 二 一一 益 , 住 乡一 益 川 法测定苹果洒中苹果酸及乳酸含量 吕兆林 ,林西邓 文红 ,欧 阳吃 林,张柏 林 “ 北京 林 业 大学分 析测试 中心 , 北京北京 林业 大 学生物 学 院 , 北京 摘 要建立了测定苹果酒中苹果酸及乳 酸含量的方法 , 即采用 配紫外检测 器及拜又 火色潜柱的液相色谱仪 , 柱温,流动相为含 。肠甲酸的甲醇水溶 液流速 。检测波 长,进 样 量川 , 通过外标法定量研究苹果酒中苹果酸及乳酸的含量 。 研究结果表明该法定 量线性关 系 良好苹果 酸标 准 曲线 的线性 相关系数为
2、, 乳 酸 的” 为 。日内进样 保 留时间 相对标 准偏 差在 。以 内 ,峰面 积 在以内 ,日间进样保 留时 间的在 。以内峰面积的在以内苹果酸的最低检出限以 可 达最 小 检 测 量可 达, 乳 酸 的可达了 ,为 卜 述 方法对于测定苹果酒 中苹果 酸及乳 酸含量线性关 系良好 、 重现性 好 、 灵敏度高 。 关锐词高效液相色谱法苹果酸乳酸含量测定 一,一,孔 气一,一 一一, 一, 拜只 , , ,拜 一 。, 、 ,飞 一、一 、 一一, 一一 一一 苹 果酒 中有机 酸 的组成 与含量 是决 定苹 果酒 风 味 和 品质 的重 要 因素 之一 一一 。酒体 的味 感 取决 于
3、 甜 味 、 酸 味和 苦味 之 间平衡 的和谐 程度 , 有 机 酸的 种 类及 其浓 度 具有 调节“酸碱 的平 衡 ” 作用 , 影 响 着 苹果酒 的酸 味一 几 一。基 于有 机 酸 对苹 果酒 风味 品 质 的 贡献 , 有 机酸 的定 量 分析倍 受 关注 。 目前 , 检 测 有 机 酸 的 方 法 有 分 光 光 度 法 、 酶 法 、 薄层色谱法 、 气相色 谱法 、 液相色谱 法卜 习。 分 光 光度法 是 以 有机 酸 和一些 特定 物 质反 应能 生 成 有 色物 质 为机 理 测 定 有 机 酸 含 量 , 该 法 易 受 干 扰 , 通 常需 要将 提 取液 进行
4、 沉 淀 、 离子 交换 树 脂等 前 处 理 , 步骤 繁冗 。酶法虽 然 特异 性较 强 , 能 够测 定 有 收 稿 日期工 一一 别 基 金 项 目国家 林 业 局 洲项 口“苹 果 酒 规模 化 发酵 工 艺新 技 术 引进 ”项 口编 号 作者简介吕兆林一女 ,博士副教授 一 精 细 与 专 用 化 学 品第卷 第期 机酸的构型 , 但是每次只能测定一种有机酸 , 比较 耗时 。气相色谱法的灵敏度和选择性相对较好 , 但 是 由于主要 的短 链有 机酸 是非挥 发性 酸 , 需 要将 有 机酸衍生化 , 且常因为衍生化反应不易定量而直接 影响测定结果 的准确性川 。高效液相色谱法是
5、 目前 分析有机酸的较优方法 , 广泛应用于果蔬及其制品 中有机酸含量的测定巨 卜 。何 海霞等用反相高效 液相色谱 的方法 测定 了芦荟及 芦荟饮料 中的有机 酸 口, 贾洪锋等用反相高效液相色谱法测定 了发 酵辣椒中的有机酸 。而使用高效液相色谱法测 定苹果酒中的苹果酸及乳酸的方法鲜有报道 , 由于 不同样品基体的复杂性 , 现有的一些方法通用性较 差 , 该研究将有利于苹果酒品质评价及性质评定 。 本文系统研究了苹果酒有机酸的反相高效液相 色谱分析法 , 对色谱柱的型号 、 流动相的配比 、 流 速 、 检测波长等色谱条件进行了优化 , 为苹果酒有 机 酸 的深人研 究 奠定 了基 础
6、。 材料 与方 法 实验材 料 实验室 自制 的苹 果酒 样品一 苹 果酸色谱 纯,公 司一 乳 酸色谱纯,公 司一 苹果酸分析 纯甲醇色谱 纯甲酸 色谱纯。 实 验仪 器 分析天平, 德 国赛多利斯 公司一 旋涡混合器 , 上海隆拓仪器设备有限 公司一型数控超声波清洗器 , 江苏省昆 山市超声仪器有限公司循环式多用真空泵珍 , 郑州长城科工贸有限公司高效液相色谱仪 , , 配紫外检测器计 , 德国赛多利 斯 公 司 。 样 品预 处理 将苹果酒样品在室温静置平衡后 , 先经滤纸过 滤 , 再经拜微孔滤膜过滤 , 稀释倍 , 直 接进样 。 仪器及 其条 件 色谱柱拌 柱温流动相甲酸 甲醇 ,
7、 使用前经过 。拼混合纤维树脂膜抽真空 过 滤流 速川进 样 量拜检 测 波 长。 有机酸定 性将 苹果酒提取 液色谱 图与苹果 酸 、 乳酸标准品色谱图进行对照 , 根据保留时间初 步确定苹果酒中有机酸种类 , 同时用加样外标法和 光谱图数据进行辅助定性 。 有机酸定量配制一 苹果酸和一 乳酸的混合 标液作为母 液 , 依次稀释得 到个浓 度苹 果酸 、和乳 酸、和。 各 浓 度 梯 度 的混 合 标 样 按 照 高 效 液 相 色谱 法 分析条件进行实验 , 每个水平 点重 复进 样次 , 以峰 面积对 质 量 浓度, 作图 , 绘制出标准曲线 。 结果 与 讨 论 液 相色谱 分离条 件
8、 的选择 在苹 果酒 的有 机 酸检 测 中 , 重 要 的是 优选有机酸的色谱分离条件 , 这些条件涉及色谱柱 型号 、 流动 相配 比 、 流 速 、 检测 波长 等 。 色谱 柱 的选择 液相色谱柱是液相色谱的分离系统 , 在混合物 中各组分准确定性定量方面起着重要的作用 , 为了 使苹果酒在上有 良好的分离效 果 , 首先对 使用的色谱柱进行了优选 。本实验选用 了种型号 的柱子 , 即 一柱 ,拌 柱 ,拜 柱 ,拜只 。以苹果酸一 乳酸混和标样及 自制苹果酒为样 品考察了种柱子的分离效果 , 在相同的洗脱程序 下进行测试 , 得 到的色谱 图见 图。从 图可看 出 , 在相 同 的
9、分 析 时 间 下柱具 有 更 好 的分 离 效 果而 考 虑 分 离 效 果 近 似 的 情 况 下 , 柱能在最 短的时 间内将苹果酸和乳 酸有 效 分 离 , 只需即 可 分 析 一 个 样 品 。这 是 由于所用 的柱拼 只 是一种快速分离色谱 柱 , 该柱颗粒粒径 比普通柱要小 , 为拼。快速分离 柱高效液相 色谱法与传统高效液相色谱法相 比 , 具有分离时间 短 , 分析速 度快 , 流动 相消 耗小 , 分 析成本 低等 优 点 “一 。为高 效地 完 成 测 试 工 作 , 本 研 究 在 各 峰 分离效果较好的前提条件下 , 尽可能让所需的分离 时间缩短 , 因此我们最终选择
10、 了柱 作为实验用分析柱 。 20 1 2年月吕兆林 等目法测 定苹 果酒 中苹 果酸 及 乳酸含 量 益果酸 苹果酸 ,目刀 刀 目月 呱气川 弓加生田 时 间 八 琐酸 、 时间, 为 匀淤绷崔 苹 果 酸 匕 酸 一 州挤创咔 时 间朋 由上 至 下分 别 为一柱 尹产柱 。 图种 型号 的色谱 柱 对应 的图谱 流 动相 成 分的选 择 色谱柱流动相配 比影响着流动相 的值 , 从 而对柱效和峰的分离均有影响 , 磷酸盐一 磷酸体 系 是反相高效液相色谱法测定有机酸常 用 的缓冲盐 , 常 用 的 磷 酸 盐 有、,和 。由于过高浓度 的缓 冲盐会使 得疏水性 色谱柱 的柱效降低或者使
11、色谱柱结晶或塌陷 , 影响 色谱柱 的使用寿命 , 因此 , 在本实验中采用 低浓度 的甲酸作为缓 冲液 , 并加入适量的甲醇 , 以 改善有机酸分离效果和峰形 。实验中甲醇添加量为 和。当甲醇添加量为时 , 苹果酸和乳酸 峰型较 好 , 且 不易受其他 峰的干扰而添加 量为 时 , 随着甲醇在流动相 中比例的加大 , 使得流 动相的缓 冲能 力降低 , 峰型出现 裂分而且有 所拖 尾 , 苹果酸与乳酸无法有效分离 , 为了使物质彻底 分离 , 故 选择 甲醇 的添 加量 为。 检 测 波 长的选择 根据苹果酸和乳酸在一吸光度的波 长扫描如 图所 示, 苹 果 酸 最 大 吸 收 波 长 均
12、在 左右 , 乳 酸最 大 吸 收 波 长 为, 发 现 当波长为左右时 , 响应值较大 , 但倒吸峰噪 音亦较大 , 当增大吸收波长时 , 响应值则相应减小 , 因此在本实验中选择为紫外检测波长 。 , 习 毛 划哥领半 岳领半划 , 一平奖 鲁军不召平月 旧、 口犯幻扣 图苹 果酸 和乳 酸波 长 扫描 流 速的 选择 流速 同样是影 响 分离 效 果 的一 个重 要 因 素 , 流 速过低则分离时间过长 、 柱效差而流速过高又导 致峰挤在一起 分不开 。本实验使用 拼色谱 柱 , 分 析 了、 。、流速下有机酸标样的色谱图 。观察 发现使 用流速测定样 品时 出峰 比较缓 慢 , 不利
13、于快 速 测定时 峰不 能 很好 的 分开当使用流速测定样 品时则 比较好 地解决 了出峰慢 和峰型 差的 问题 , 易于样 品测定 。 进 样 浓度的 选择 选 用不 同浓 度苹 果酒 样 品进 样进 行液 相色 谱分 析 , 结 果如 图所示 。从 实验 的结 果 看 出 , 发 酵所 得 的苹 果酒 原样 浓度 较 大 , 色谱 峰堆 叠 , 经过 稀 释 后能使组分有效分离 , 色谱图大有改观 , 最终选定 进 样浓 度 为苹 果酒倍 稀 释浓 度 。 川年月 吕兆林 等日 戈 法测定 苹果 酒 中苹 果酸及 乳 酸含量 精 确 度 以 苹果酒 中苹果 酸 和乳 酸的峰 面积 和保 留
14、时 间 来评价该方法 的精确度 , 按 照的分析 条件进 行 实验 , 做苹 果酒 日内与 日间 的重现 性 ,日 内连续 进 样次 ,日间 每进 样一 次 , 保 持, 以保 留时 间 和 峰 面 积 的相 对 标 准 偏差,一 来评价 该 方法 的 准确 度 。表显 示 了苹 果 酒 中 苹果酸和乳酸 日内 、 日间保留时间和峰面积的重现 性 。从表中可知 ,日内进样保 留时 间的在 以 内 , 峰 面 积 的在以 内日间 进 样 , 连 续分 析, 每 天 固定 在 上 午 进 样 , 保 留 时 间的在之 内 , 峰 面 积 的在 。 一之 间 , 说 明该 分析方 法 比较稳 定 ,
15、 测 定结 果准确可靠 。 表苹果酸和乳酸保留时 间和峰面积 的精确 度 苹果酸乳酸 保 留时间峰面积保 留时 间峰面积 内 姜 间 最低检 测限一和最低定量限及 将 浓度 为的苹 果 酸标 准 溶 液及 浓 度 为的乳酸 标准 溶液 用 甲醇 水 溶 液逐 级 稀 释 , 对 实际 样 品按 照的分 析 条件进 行 实验 , 以 信噪比的检测量 为, 以信 噪 比 的检测量为。通过实验测得 , 苹 果酸 的砂可 达矛 ,了可 达 碑 乳 酸 的可 达,碑可 达 , 证 实 该方 法具 有较 高 的灵敏 度 。 总结 确定 了 测 定 苹 果 酒 中 苹 果 酸 及 乳 酸 含 量 的 ,检
16、测 条 件色谱 柱拼 义义检 测 波 长流 动 相 甲 酸肠 甲 醇流 速。柱 温 进样体积拼 , 。 该方 法测 定苹 果酒 中苹 果 酸及 乳酸 含量线 性 关 系 良好 、 重 现性 好 , 精确 度 和灵敏 度高 , 能 够 获得 较好 的有 机 酸标 准 品和苹 果酒 有机 酸 的色谱 图 。该 研究 为苹 果酒 有 机酸 的深 入研 究奠 定 了基础 , 为苹 果酒 品质 评 价及 性质 评定 提供 了有 效 的研究 方法 。 参考 文献 马兆瑞苹果洒酿造技术仁北京 中国轻工业出版社 潘海燕苹果酒苹果酸一 乳酸发酵的研究 剑江南大学 , 二潘海燕徐岩王栋 等苹果酒苹果酸乳 酸菌顺序 发酵工 艺 的研究二 食品科学,一 李记 明 , 司合芸樊 玺 等苹果酒酿造 中的苹 果酸一 乳酸 发酵 口 食 品与发酵 工业 ,一 祝战斌 , 马兆瑞苹果酸一 乳酸发酵 对苹果酒 风味的影 响 酿 酒 ,一 牛金刚 , 梁晓静 , 刘霞 ,等分光光度法测 定水溶液 中的有机 酸含量口 应 牛 化学 ,一 仁常伟刘延琳等葡萄酒 的有机酸
