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1、细菌形态学检查法（二）三、染色标本的检查 细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。一般形态学检查均需染色。(一)常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。助色基有的为碱性(如一NH2)，有的为酸性(如一OH)，因此助色基的性质决定染料的酸碱性。常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。1碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红
2、等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。多数细菌等电点(pI)在25之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。2酸性染料 常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。3中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。 (二)常用的细菌染色法 根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、
3、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。 革兰染色 本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G)菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。 革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：细胞
4、壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；等电点学说：G+菌的等电点低(pI 23)，G菌等电点较高(pI45)，在相同pH条件下，G+菌所带负电荷比G菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色；化学学说：G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色，G菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的丰要原因。革兰染色可用于菌落涂片和标本涂片。菌落涂片不仅可观察细菌的形
5、态染色特点，更重要的是可以为后续选择合适的鉴定程序提供参考依据。另外，由于G+菌和G菌细胞壁结构存在很大差异，对一些抗生素表现出不同的敏感性，且二者产生的致病物质及作用机制不同，因此革兰染色尚可为临床选择用药提供参考，帮助临床制定有针对性的治疗方案。在临床上除少数标本(如粪便、血液)外，绝大多数标本在分离培养前都要进行革兰染色。2抗酸染色抗酸染色是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法，其中最具代表性的是萋-尼染色法。经此法染色可将细菌分为抗酸性细菌和非抗酸性细菌两大类。由于临床上绝大多数细菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等疾病的细菌检查。
6、疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后在油镜下观察，根据所见结果报告“找到(或未找到)抗酸菌”，可作出初步鉴定。另外，若改变脱色剂，诺卡菌属亦可呈弱抗酸性。目前认为，抗酸染色性的差异可能与菌体中所含的分枝菌酸、脂类等成分有关。3荧光染色荧光染色是用能够发荧光的物质对标本进行染色，在荧光显微镜下观察发荧光的细菌。此法具有敏感性强、效率高、结果易于观察等特点，故在临床细菌鉴定中有很大的应用价值。目前主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等病原菌的检测。如痰标本涂片、固定后用荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)染色，在荧光显微镜下可观察到是金黄色荧光的菌体。 4负染色
7、是一种使标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。常用染液有墨汁，也可用酸性染料如刚果红、水溶性苯胺黑等，因酸性染料带负电荷，故菌体不着色，只能使背景着色。实际工作中还可用墨汁负染色法配合单染色法(如吕氏亚甲蓝)检查细菌的荚膜，镜下可见黑色背景中蓝色菌体周围包绕一层无色透明的荚膜。5特殊染色细菌的特殊结构如芽胞、鞭毛及荚膜等和其他结构如细胞壁、核质及胞质颗粒等，用普通染色法均小易着色，必须用相应的特殊染色才能染卜颜色。常用的特殊染色法有细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、鞭毛染色及异染颗粒染色等。鞭毛染色后在显微镜下不仅可以观察到有无鞭毛，还可进一步观察到鞭毛的位置以及数量，在细菌鉴定，尤其是非发酵菌的鉴定中具有重要价值。荚膜染色用于有荚膜细菌的鉴定，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌及产气荚膜梭菌等的鉴定。异染颗粒主要用于白喉棒状杆菌的鉴定，如疑为白喉棒状杆菌感染，进行涂片检查，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，尚需用异染颗粒染色检查有无异染颗粒，若有方可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”，为临床早期诊断提供依据。
