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1、Unstained Protein Molecular Weight Marker SM0431 分子量大小范围 14.4-116 kDa。 即用型 提供上样缓冲液，可直接凝胶上样。 锐利条带。 应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western 杂交精确鉴定蛋白大小。 说明 未预染蛋白 Ladders 和 markers 设计用于 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)、硝酸纤维膜、尼龙膜或 PVDF膜精确鉴定蛋白的分子量大小。 Unstained Protein Molecul
2、ar Weight Marker 是由 7 条天然蛋白组成的混合物，分子 量范围为14.4-116 kDa。 未预染 Ladder 和 marker 经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后用 PageBlue Protein Staining Solution (#R0571)、 PageSilver Silver Staining Kit (#K0681)或其它蛋白染色方法染色显示条带非常窄。 PageBlue Protein Staining Solution 也可用于 PVDF 膜上未预染分子量标准条带的染色观察。 组分 0.1-0.2 mg
3、/ml of each protein in 62.5 mM Tris-HCl (pH 7.0 at 25C), 1 mM EDTA, 2% SDS, 50 mM DTT, 30 mM NaCl, 1 mM NaN3, 0.01% 溴酚蓝和 50% 甘油 . 质量控制 测试： Western 杂交检测和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 保存 -20C 保存。 Patents, Licenses, Trademarks 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳常规推 荐 低浓度凝胶推荐用于分析大分子蛋白；高浓度
4、凝胶推荐用于分析小分子蛋白。 线性梯度凝胶对宽分子量范围的蛋白具有高分辨率。 凝胶推荐 蛋白分子量范围， kDa 推荐的凝胶浓度， % 5-50 18 5-60 16 10-80 14 20-150 12 30-200 10 40-250 8 60-300 6 100-400 4 蛋白分子量范围， kDa 推荐的梯度凝胶浓度， % 5-100 10-20 5-300 4-20 10-200 8-16 30-300 4-12 Fermentas 所有蛋白分子量标准均适用于 6, 8, 10, 12, 14 % SDS 聚丙烯酰胺凝胶和4-12%, 8-16%
5、, 4-20%和 10-20%的梯度凝胶。 以下原则适用于蛋白分子量标准和蛋白样本： o i低浓度凝胶 (4-8%)中，小分子量的蛋白 (10-15 kDa)在电泳时与示踪染料一同迁 移，蛋白条带可能不可见。 o 高浓度凝胶 (14-18%)中，大分子量蛋白 (150-250 kDa)不能分离。 如需精确鉴定蛋白的分子量大小，推荐使用未预染的蛋白分子量标准。 预染蛋白分子量标准适用于监控蛋白电泳进程和 Western 杂交时蛋白转膜效率。 预染蛋白偶联的生色团会影响蛋白迁移率，因此其在不同 SDS-PA
6、GE 缓冲液和凝胶系统中迁移率不同。预染分子量标准推荐用于蛋白分子量大小粗略测定。 每个批号的预染蛋白 Ladder/marker 均经过分子量大小精确鉴定的未预染蛋白Ladder/marker 校准 (Tris-glycine-SDS 凝 胶电泳 )。预染蛋白 Ladder/marker 计算出来的表观分子量请参考产品质检报告。预染蛋白在其它电泳缓冲液和凝胶体系中具有不同的电泳迁移率。 天然蛋白的修饰，如磷酸化和糖基化，均会改变蛋白的迁移率。修饰蛋白的表观分子量可能与同分子大小未修饰蛋白的分子量不同。 蛋白 Ladder/Marker：上样推荐 &nb
7、sp;1. 室温或 37C 融化 Ladder 几分钟，确保试管中的固体完全溶解。 2. 轻轻混匀，确保溶液完全混匀。 3. Unstained Protein Molecular Weight Marker: o 转移相应量的分子量标准到新的旋盖管。 o 95C 加热 10 分钟。 o 冷却后混合。 融化后，该分子量标准必须变性后才能 用于后续实验 。 4. 上样 (凝胶将用于 PageBlue Protein Staining Solution (#R0571)或其它 Coomassie 染料染
8、色；或用于 Western杂交 ): o 小凝胶： 5 l/泳道，凝胶厚度 0.75-1 mm。 o 大凝胶： 10 l/泳道，凝胶厚度 0.75-1 mm。 Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder: o 小凝胶： 10 l/泳道，凝胶厚度 0.75-1 mm。 o 大凝胶： 20 l/泳道，凝胶厚度 0.75-1 mm。 备注 为避免银染时凝胶过量上样， Ladder/marker 使用前按以下方法稀释： 水，无核酸酶 (#R0581): 36.5 l &
9、nbsp;5X Protein Loading Buffer*: 10 l 20X Reducing Agent (#R0891): 2.5 l Protein ladder/marker: 1 l * 也可使用 4X DualColor Protein Buffer Loading Pack (#R1011)。缓冲液和水的体积需相应调整。 观察预染的蛋白 Ladders/markers 无需再次染色。 如需观察未预染的蛋白 Ladders/markers ，可用 PageBlue Protein Staining Solutio
10、n (#R0571) 、 PageSilver Silver Staining Kit (#K0681)或其它蛋白染色技术染色凝胶。 蛋 白样本： SDS-PAGE 电泳前处理 步骤 DualColor Protein Loading Buffer Pack (#R1011) 处理样本 Protein Loading Buffer Pack (#R0891) 处理样本 融化 室温或 37C 融化缓冲液几分钟，确保试管中的固体完全溶解。 混合 轻轻混匀，确保溶液完全混匀。 &
11、nbsp;稀释 2.0 l 20X Reducing Agent 2.5 l 20X Reducing Agent 蛋白样本 (0.5 ng 2.5 g) 如需 Western 杂交或 Coomassie 染料染色，每孔（小凝胶）上样可达 2.5 g 总蛋白。 如需银染，每孔（小凝胶）上样可达 10 ng 总蛋白。 10 l 4X DualColor Protein Loading Buffer 水，无核酸酶 (#R0581) 至 40 l * 10 l 5X Protein Loading Buffer 水，无核酸酶 &
12、nbsp;(#R0581) 至 50 l * 变性 95-100C 孵育 5 分钟。 上样 短暂离心后直接上样 SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 上样量： 10 l/孔（小凝胶）。 * 样本体积可适当放大或缩小 。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳操作方法 I. 试剂 30%丙烯酰胺 /双丙烯酰胺溶液 (37.5:1)溶液 (黑暗保存 ) 1.5 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.8) 0.5 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 6.8) 10%过硫酸胺 (APS)溶液
13、 (新鲜配制 ) TEMED 1X Tris-glycine-SDS Buffer (#B46) (10X 浓度，使用前稀释至 1X 浓度 ) 警告： 丙烯酰胺有神经毒性，处理其粉末时请戴好手套、安全眼镜和外科面具。 II. 分离胶制备 组分 s 体积： 10 ml 分离胶溶液 (2块小凝胶 ) 8%凝胶 10%凝胶 12%凝胶 去离子水 4.73 ml 4.13 ml 3.43 ml 30% 丙烯酰胺 /双丙烯酰胺 2.7 ml 3.3 ml 4.0 ml 1.5 M Tris-HCl 含 &nb
14、sp;0.4% SDS, pH 8.8 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 10% APS 60 l 60 l 60 l TEMED 13 l 13 l 13 l III. 浓缩胶制备 组分 s 体积： 5 ml 浓缩胶溶液 (2 块小凝胶 ) 去离子水 3.0 ml 30%丙烯酰胺 /双丙烯酰胺 700 l 0.5 M Tris-HCl 含 0.4% SDS, pH 6.8 1.25 ml 10% APS 25 l TEMED 20
15、 l IV. 程序 1. 组配制胶装置，在两块玻璃板 (边缘 )之间加入间隔物，形成三明治形式。按上述方法制备分离胶溶液。 2. 最后加入 APS 和 TEMED，小心混匀避免产生气泡。 3. 重要提示： 混合物中加入 APS后，聚合反应立即开始，后续操作须立即执行。 4. 用枪头小心将凝胶溶液注入两块玻璃板之间的空隙。留出大约 1/4 的空间 (制备浓缩胶用 )。小心在分离胶顶部覆盖 50%异丙醇、 0.1% SDS 溶液或水，静置约 30 分钟使分离胶聚合。当聚合反应完成后，分离胶和覆盖的溶液之间会产生清晰线条。 5.
16、 除去水、异丙醇或 SDS溶液，轻轻用双蒸水洗涤。 6. 用枪头小心加入浓缩胶溶液 (按上述方法准备浓缩胶，最后加入 APS和 TEMED)，避免产生气泡。 重要提示： 混合物中加入 APS后，聚合反应立即开始，后续操作须立即执行。 7. 插入梳子，静置凝胶聚合至少 60 分钟。 8. 小心除去梳子。将凝胶放入电泳 槽中。电泳槽底部和顶部的溶液池中倒入新鲜配制的 1X Tris-glycine-SDS缓冲液。确保缓冲液完全覆盖凝胶点样孔。 9. 上样。 根据凝胶数量选择适当的电压和电流。当染料前端进入电泳胶后增
17、加电压。确切的电压值请见下表： 凝胶 1 块小胶 2 块小胶 浓缩胶 (顶部 ) 13 mA 25 mA 分离胶 (底部 ) 25 mA 50 mA 此处的数值是针对 0.75 mm厚度凝胶。如果凝胶厚度更大，需相应调整电压。 当染料前端抵达凝胶底部时停止电泳，剥下凝胶后染色或 Western 杂交。 PageBlue Protein Staining Solution (#R0571)染色程序 使用微波处理 (快速方法 ) 不使用微波处理 (常规方法 ) 总时间 非变性凝胶： 25 分钟 &nbs
18、p;含 SDS变性凝胶： 40 分钟 非变性凝胶： 65 分钟 含 SDS变性凝胶： 95 分钟 1. 水洗 *, x 3 加热 100 ml水 微波处理 1 分钟 加入 100 ml水洗涤 倒掉水 轻摇，洗涤凝胶 5 分钟 倒掉水 2. 染色 加入 20 ml PageBlue Protein Stainin Solution 微波处理 30 秒钟 轻摇，染色凝胶 20 分钟 倒掉溶液 加入 20 ml PageBlue Protein Staining Solution 轻摇，染色凝胶 60 分钟 (或过夜 ) 倒掉溶液 3. 水洗 加入 100 ml水，洗涤 5 分钟 加入 100 ml水，洗涤 5 分钟 * 只适合含有 SDS的凝胶 备注 1. PageBlue Protein Staining Solution 可重复使用 3次，且不会
