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1、Western blot 实验技术,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支
2、持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,快速、特异，信号弱、昂贵,信号强、二抗选择多，非特异性结合,Western Blot一般流程,SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,蛋白样品的制备,蛋白样品的制备,裂解液,只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS),SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺
3、基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,安装玻璃板,对齐、加紧,配胶,混匀、不要过度，防止氧化,转膜,大于20KD0.45 um 小于20KD0
4、.2 um 小于7KD0.1 um,转膜,半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间。（小分子量蛋白） 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中。（大分子量蛋白）,不能有气泡 不要污染膜的表面 注意正负极 冰浴冷却,湿转,半干转,不能有气泡 滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热,封闭,脱脂奶粉（5） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次
5、，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不能重新剥离检测 ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条
6、带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,没有阳性条带或比较弱,
