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1、1,HLA-B27检测及其临床应用,许泼实 河南省人民医院检验科,2,HLA-B27及其临床应用,什么是HLA及HLA-B27 MHC、HLA、亚型、关联、RR HLA-B27与哪些疾病相关 血清阴性脊柱关节病 类型及特点 强直性脊柱炎 特点及其与B27关联机制 HLA-B27 怎么检测 MLCT、ELISA、IMS-ELISA、FCM、PCR-SSP,3,HLA相关概念,主要组织相容性抗原 主要组织相容性复合体（ MHC 类)：H-2 SLA HLA MHC、HLA复合体基因 MHC分子、HLA分子抗原 HLA：人类白细胞抗原（ Human Leukocyte Antigen）,4,HLA相
2、关概念,5,HLA-B27相关疾病,6,血清阴性脊柱关节病共同特点,RF（一） 家族聚集现象 与HLA-B27不同程度相关 皆可影响脊柱，都有不同程度的骶髂关节炎，也可影响外周关节，下肢关节多于上肢关节，且呈不对称性。 与革兰氏阴性杆菌有一定相关性：强直性脊柱炎与肠道肺炎克雷白杆菌相关Reiter综合征与沙眼衣原体、福氏痢疾杆菌相关反应性关节炎与沙门杆菌、痢疾杆菌、耶尔森菌和HP相关,7,血清阴性脊柱关节病共同特点,临床上有很多共同或重叠之处： 眼炎，尿道炎，前列腺炎，口腔、肠道和生殖器溃疡结节性红斑，银屑病样皮疹坏死性脓皮病，血栓性静脉炎 基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附
3、着端炎)而非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。,8,HLA-B27相关疾病：强直性脊柱炎,Ankylosing Spondylitis，AS 患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向； 主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织） 可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直 B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！ AS不是RA的一种特殊类型！,9,HLA-B27与AS,10,HLA-B27与AS,健康人群HLA-B27阳性率及AS患病率各地区、种族有显著的差异
4、 HLAB27与强直性脊柱炎的发病有很强的相关性 两种错误认识：HLA-B27阳性AS！ HLA-B27阳性不会转阴！,11,HLA-B27与AS的关联机制,连锁不平衡学说 分子模拟学说 关节源性肽假说 其他：T细胞受体库假说超抗原假说B27修饰因子假说Cys67模型,张谷香医学综述，2012,18(4):498-501,HLA基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。,B27抗原与某些G（-）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把B27当作病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。,认为关
5、节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由HLAB27提呈，正常情况下递呈水平低，反应T细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T细胞，从而识别以低水平递呈的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。,12,HLA-B27检测方法及评价,抗原水平 微量细胞毒法 84% ELISA IMS-ELISA 88% 流式细胞术法 93% 基因水平 PCR-SSP 96%,13,微量细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）,原理：如果受试者淋巴细胞表面表达有相应的HLA-B27抗原，就可以与B27抗体结合，形成Ag-Ab复合物激活补体，发生对细
6、胞膜的破坏及细胞杀伤作用，通过染色法观察，死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入使之着色，而活细胞细胞膜完整不被染色。根据死细胞占全部细胞的百分比，可以判断受试者淋巴细胞表面是否存在HLA-B27抗原及其与抗体的反应强度。 优点：不需特殊仪器设备，易于操作，一般的实验室都可开展。 缺点：标本存放不能超过8小时；感染可以使细胞膜表面的B27分子的数量或结构改变，影响MLCT的结果，易出现假阴性。,J.Kirveskari, et al. British Journal of Rheumatology, 1997,36:185-189,14,ELISA,原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中
7、HLA-B27水平。用纯化的B27抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27抗原（待检标本）、生物素化的抗HLA-B27抗体、HRP标记的亲和素，形成双抗体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HLA-B27呈正相关。 其结果与MLCT法符合率为99，且不受感染因素的影响，重复性好。,瞿良等实用医学杂志，2005,19(21):2190-2191,15,磁珠酶联免疫分析（IMS-ELISA）,磁珠分离与ELISA结合B27单抗标记磁珠HRP标记CD45单抗通过磁场分离游离相 优点： 反应时间短（1小时完成
8、） 对标本新鲜度要求不高 28静置4 d之内可用,杨雅琼等现代检验医学杂志，2002,17(2):60-62,16,流式细胞术法,利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比，从而判断HLA-B27是否阳性。 优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判断准确，为目前较为理想的方法，国外已将FCM法检测HLA-B27作为AS 诊断的常规检测方法。 缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院应用，且荧光易淬灭。,Levering WH，et al. JCytometry B Clin Cytom，2003,54(1):28-38,17,PCR-SSP,通过设计基因序列特异的引物SSP，特异性的扩增出标本中的HLA-B27基因片段，以琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，若出现目的条带则表示HLA-B27为阳性。 优点：基因水平的检测 直接对HLA-B27原基因进行扩增分型，灵敏度高，特异性强。 缺点：耗时长，需要跑电泳，需要特定的实验仪器及严格的实验条件，在临床上普遍开展此项检查有一定的难处。,Olerup OTissue Antigens，1994,43(4):253-256,18,万事有其本源， 而不是去教条的 接受其存在。,
