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1、工业发酵菌种选育,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,适于改良品种的个别性状 育种程序简单，年限短 变异的方向和性质不定 与其它育种方法结合使用，将发挥巨大作用 提高突变率，扩大“变异谱”、创造新类型,诱变育种的意义及特点,概念 以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条见下合成有效产物。,诱变育种步骤,出发菌株的选择 处理
2、菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。,(二)处理菌悬液的制备,诱变育种要求所处理的细胞必须是对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 为什么不选择多细胞的菌悬液？ 为什么选择对数生长期的菌？,(三)诱变处理,根据后面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，
3、即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。,（二）诱变育种应注意的问题,诱变成功的关键： 出发菌株的选择 诱变因素的选择 诱变剂量的选择 单孢子（或单细胞）悬液的制备,出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3已经诱变过的菌株，再诱
4、变易产生负突变，再度提高产量比较困难，但也有可能会发生正的突变。,诱变因素的选择,诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂 主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。 诱变方法：单一诱变剂处理 复合诱变剂处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂：碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变
5、剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。,2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,不同的菌株选用不同的诱变剂！ 野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。 遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。,单孢子悬液的制
6、备,细胞的要求：处于对数生长期，并且是均匀状态的单细胞悬液。 获得单细胞悬液的方法必须要有针对性。 例如：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。,（三）常用的物理 诱变剂处理方法,紫外线诱变 紫外线的主要作用 光复活作用 光谱范围与有效光谱范围 40-390nm 200-300nm；260nm,如何避免光复活作用？,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞
7、为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,(二)操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。,3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。,
