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1、基因工程专题复习,基因工程，通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因工程的概念,DNA重组技术或基因拼接技术,生物体外,基因重组,人类需要的生物类型和生物产品,定向改造性状、打破物种界限,剪切拼接导入检测表达,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”- “分子缝合针”- “分子运输车”-,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 载体,DNA重组技术的基本工具,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶 化学本质
2、：蛋白质。,1、来源：,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,可用于目的基因和载体的切割,2、特性：,限制酶是一类酶，而不是一种酶。,一、 限制酶“分子手术刀”,A,T,磷酸二酯键,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,例1.下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是 ( ) A一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B限制性内切酶的活性受
3、温度影响 C限制性内切酶能识别和切割RNA D限制性内切酶可从原核生物中提取,C,1、种类： 2、作用部位：,磷酸二酯键,二、 DNA连接酶“分子缝合针”,（黏性末端）,（黏性末端和平末端）,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,A A T T G,C,DNA聚合酶的作用,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个脱氧核苷酸加到已存在的核
4、酸片段上，形成磷酸二酯键,与DNA有关的酶,.,1下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(),A B C D,C,三、载体“分子运输车”,1、载体的作用,将 转移到受体细胞中去。,目的基因,2、常用的载体,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒,3、作为载体必须具备的条件,能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源 基因连接； 有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的
5、、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,最常用运载体质粒,.,典例1.下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是() A染色体和质粒的化学本质都是DNA B染色体和质粒都只存在于原核细胞中 C染色体和质粒都与生物的遗传有关 D染色体和质粒都可作为基因工程的常用载体,C,二、基因工程的基本操作程序,.,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC,启动子,终止子,知识点一：基因的结构,1.原核细胞的基因结构,.,编码区,非编码区,非编
6、码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,.,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,外显子,内含子,编码蛋白质,2.真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子
7、：,RNA聚合酶 结合位点,3.原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,知识点二：基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法：,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,.,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DN
8、A片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,1. 基因文库的构建方法,（1）直接分离法(鸟枪法),.,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,（2）反转录法,基因组DNA文库,cDNA文库,2. 基因组DNA文库与cDNA文库比较,2. 基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,前提条件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。,原理：_,聚合酶链式反应,
9、体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,模板DNA,（二）利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互
10、补的新DNA链,.,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。,（三）人工合成获取目的基因,人工合成,(基因序列已知，且比较小),DNA合成仪,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同
11、一种,1.基因表达载体的构建,二、基因表达载体的构建核心,限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。,2.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端, RNA聚合酶的结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,载体与表达载体的区别：与载体相比较,表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子(DNA片段)起始密码子(RNA); 终止子(DNA片段)
12、终止密码子(RNA),提醒：,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（1）农杆菌转化法,特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,1、将目的基因导入植物细胞,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,
13、基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉管通道法,适用于被子植物,方法：显微注射法 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞,.,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,3、将目的基因导入微生物细胞,思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？,用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性,四、目的基因的检测与鉴定,
14、检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,DNA分子杂交,15N,15N,14N,14N,探针,转基因生 物的DNA,变性,变性, 首先取出转基因生物的基因组DNA；, 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；, 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目
15、的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,A,D,.,3.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程,据图回答： (1)在基因工程中,AB为 技术,利用 的原理是 ,其中为 过程。 (2)加热至94的目的是使DNA中的 键 断裂,这一过程在细胞内是通过 的 作用来完成的。,DNA解旋,解旋酶,PCR,DNA复制,氢,(3)当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚 合酶的作用下,引物沿模板链延伸,最终合成两条 DNA分子,此过程中的原料是 , 遵循的原则是 。 (4)BD为抗虫棉的培育过程,其中过程常用的 方法是 , 要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后是否
