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1、血细胞分析仪测定原理与参数解析,太航医院检验科 乔军军,简 介 血细胞分析仪检测原理 血细胞分析仪检测参数原理 检测参数（报警） 临床应用,简 介,自动血细胞分析仪,早年称血细胞技术仪，已是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。 20世纪50年代初，美国W.H.Coulter申请了粒子计数法的技术专利，在世界上研发了第1台电子血细胞技术仪，并应用于临床，开创了血细胞计数的新纪元。从此，随着基础医学和高科技，特别是计算机软件技术的发展，其检测原理逐渐完善，检测技术不断创新，检测的参数显著增多。,传统手工法显微镜血细胞计数或分类方法，不仅速度慢，而且因操作过程的随机误差、实验器材的系统误差和检测
2、方法的固有误差，检测的精密度不高。 “精度高、速度快、易操作、功能强”是血细胞分析仪的强劲优势，还可和血涂片制备和染色仪进行组合，由后者完成血细胞分析仪检测后的形态学复检。,现代血细胞分析仪的功能有:1.全血细胞计数功能（红细胞、白细胞和血小板计数及其相关的计算参数）.2、白细胞分类功能（三分类或五分类白细胞百分率和绝对值）.3、血细胞计数和分类功能的扩展功能，包括：有核红细胞计数、网织红细胞计数及其相关参数检测；未成熟粒细胞、幼稚粒细胞、造血干细胞计数；未成熟血小板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表型检测等。,血细胞分析仪检测原理 一、电阻抗法 二、射频电导法 三、激光散射法,悬浮在电解质溶
3、液中的血细胞相对于电解质溶液为非导电颗粒，其电阻比电解质溶液大，利用两者导电性能的差异，体积大小不同的血细胞（或类似颗粒）通过计数小孔时，可引起小孔内、外电流或电压的变化形成与血细胞数量相当、体积大小相应的脉冲电压，从而间接区分出细胞群，并分别进行计数，这就是电阻抗原理即库尔特原理。 电阻抗法可精确测量出细胞（或类似颗粒）的大小，是三分类血细胞分析仪的主要应用原理。电阻抗法还与光学检测原理组合应用于五分类血细胞分析仪中。,一、电阻抗法血细胞计数原理,电阻抗法细胞计算原理,二、射频电导法,射频指射频电流，是每秒变化大于10000次的高频交流电磁波。电导性即电的传送性能。高频电流能通过细胞壁。用高
4、频电磁探针渗入细胞膜脂质层可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质（如比例）、颗粒成分（如大小和密度）等特征性信息。电导性特别有助于鉴别体积虽相同、但内部结构性质不同的细胞（或相似体积的颗粒）如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞两者直径虽均912um，但在高频电流检测时，因两类细胞不同核质比例而出现不同的检测信号。射频电导法结合其他检测原理一起应用于血细胞分析仪中。,射频电流检测原理,三、激光散色法流式细胞术检测原理,将经试剂稀释、染色、球形化的细胞（或其他颗粒）悬液注入鞘液流中央，单个细胞随悬液和鞘流液两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管。,鞘流技术 1.检测光；2.细胞流；3
5、.前鞘流； 4.后鞘流；5.流液方向,三、激光散色法流式细胞术检测原理,当细胞（或其他颗粒）通过激光束被照射时，细胞（或其他颗粒）因本身的各种特征（如体积大小、染色程度、细胞成分浓度或细胞核密度等），可阻挡或改变激光束的方向，产生与细胞（其他颗粒）特征相应的各种角度的散色光。置放在石英毛细管周围不同角度的信号检测器（光电倍增管）接受到特征各异的散色光。来自低角度散色光（或称前向散色光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的数量和表面体积大小；来自高角度散色光（或称侧向散色光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的内部颗粒、细胞核等复杂性。,流式细胞术检测通道和光路系统,三、激光散色法流式细胞术检测原理,如
6、细胞（或其他颗粒）用荧光染料染色,则染色后的细胞（或其他颗粒）被激光照射时，可产生不同波长的荧光散射，可用检测器接受散射荧光。将来自各种散射光的信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞（其他颗粒）。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法血细胞分群更准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。,激光散射法系统基本组成,血细胞分析仪检测参数原理 一、白细胞系列参数检测原理 二、成熟红细胞系列参数检测原理 三、血小板系列参数检测原理 四、血红蛋白浓度测定检测原理,一、白细胞系列参数检测原理,1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道：,（1）4
7、DIFF通道：利用激光流式细胞术、核酸荧光染色技术，采用专一溶血剂解红细胞和血小板，而白细胞膜仅部分溶解出现小开口，核酸荧光染料聚次甲基进入受损的白细胞内，与DNA、RNA和细胞器结合，使之着色。染色后白细胞色深（未成熟粒细胞、异常细胞染色更深，成熟白细胞荧光染色浅），红细胞不染色，血小板稍染色。因荧光强度与细胞所含核酸量成比例，从而得到4DIFF白细胞散点图，包括中性粒细胞和嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞（百分率和细胞计数绝对值）和未成熟粒细胞（百分率和细胞计数绝对值）。,白细胞分类4DIFF散点图,1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道：,（2）WBC/BA
8、SO通道：在碱性溶血剂作用下，除嗜碱性粒细胞外的其他所有细胞均被溶解或萎缩，随后用流式细胞术计数嗜碱性粒细胞，从而得到WBC/嗜碱性粒细胞百分率和细胞计数绝对值及WBC/BASO散点图。,白细胞分类白细胞、 嗜碱性粒细胞散点图,1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道：,（3）未成熟粒细胞信息（IMI）通道：用射频、电阻抗和细胞化学染色法。在细胞悬液中加硫化氨基酸，幼稚细胞与硫化氨基酸结合的量多于较成熟的细胞、且对溶血剂有抵抗作用。因此，当加入溶血剂时，成熟细胞被溶解，只留下幼稚细胞（含未成熟细胞、原始细胞、造血祖细胞）得以计数。 IMI通道可定量分析不同类型幼稚细胞，包括造血祖
9、细胞（HPC）、成熟粒细胞、原始细胞、异型/异常淋巴细胞、核左移和有核红细胞，得到HPC百分率和绝对值计数。,未成熟粒细胞 信息通道散点图,2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS）,用钨光源流式细胞光吸收、化学染色和电阻抗法：白细胞计数通道：用电阻抗法检测。嗜碱性粒细胞通道：用专用染液染色，嗜碱性粒细胞具有抗酸性，而其他细胞胞质溢出，成为裸核，用电阻抗法检测，用电阻抗法检测，所得结果与白细胞/血红蛋白通道（采用鞘流阻抗法测定白细胞）的白细胞结果进行比较。,嗜碱性粒细胞计数直方图,2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS）,白细胞分类通道：双鞘流系统中，用流式细胞光吸收、电阻法和细胞化学染
10、色液对细胞胞质和蛋白组分染色，检测除嗜碱性粒细胞以外的白细胞；在幼稚红细胞通道，荧光染色，进行白细胞分类。,白细胞分类计数散点图,2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS）,DHSS技术：在流式通道中有2个鞘流装置，细胞经第1束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积，然后经第2束鞘流后到达光窗，测定细胞的光吸收，分析细胞的内部结构。,双鞘流图,2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS）,DHSS技术：染色剂中含有溶血素及氯唑黑E活体染色，溶解红细胞，对单核细胞初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞特异颗粒进行染色，同时对细胞膜、核膜、颗粒膜染色，得到中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、
11、异型淋巴细胞和巨大未成熟细胞（LIC）散点图结果。双矩阵LIC散点图可将幼稚细胞分为3个亚群：未成熟粒细胞（IMG）：包括异常中性粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞、原始粒细胞。未成熟单核细胞（IMM）：包括幼稚单核细胞、原始单核细胞。未成熟淋巴细胞（IML）：包括幼稚淋巴细胞、原始淋巴细胞等。,双矩阵巨大未成熟细胞（LIC） 散点图 （IMG未成熟粒细胞、IMM未成熟单核细胞、IML未成熟淋巴细胞）,二、成熟红细胞系列参数检测原理,光学法检测网织红细胞、成熟红细胞和血小板散点图,1、电阻抗法 依据红细胞大小和数量进行红细胞计数 2、流式细胞术、鞘流电阻抗法 红细胞/血小板计数通道：当
12、红细胞计数你和血小板计数结果异常时，可提示转换至Ret/PLT-O光学检测通道，用光学法测定血小板（PLT-O），得到与红细胞计数和血小板计数相关的众多参数。,正常红细胞直方图,3、流式细胞术激光散射法,红细胞/血小板检测通道：用稀释液十二烷基硫酸钠（SDS）使红细胞/血小板成为球形并经戊二醛固定，红细胞被激光照射后，所得信号相同，且不影响MCV的测定。用低角度光散射测量红细胞体积与总数，高角度光散射检测单个血红蛋白浓度，可准确测定MCV、MCH、MCHC值，得到红细胞散点图；同时可测定单个红细胞体积及红细胞内血红蛋白含量，得到相应直方图及RDW、HDW等参数。,三、血小板系列参数检测原理,1
13、、电阻抗法 依据血小板大小和数量进行血小板计数。在电阻抗法血小板计数时，有的还采用3次计数、扫流和拟合曲线等计数准确性。 2、流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗法 红细胞/血小板计数通道：用鞘流电阻抗法测定血小板计数（PLT-I）结果异常时，仪器转换至光学法核酸荧光染色网织红细胞/血小板检测通道，用光学法测定血小板（PLT-O）。核酸（DNA/RNA）荧光染色时，未成熟网织血小板染色多，成熟血小板染色少，并显示PLT-O散点图结果，可得到未成熟血小板比率（IPF）、光学法血小板计数（PLT-O）、电阻抗血小板计数（PLT-I）、血小板比容（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、血小板平均体积（MP
14、V）、大血小板比率（P-LCR）。成熟红细胞无DNA/RNA，不被染色，从而得以在体积大小和核酸染色上与血小板鉴别。,四、血红蛋白浓度测定检测原理,用光学比色原理测定血红蛋白浓度，有2类稀释液。 1、改良氰化高铁血红蛋白法 测定波长540nm，稀释液含氰化物成分。 2、非氰化高铁血红蛋白法 即稀释液不含氰化物配制的成分。如SLS-Hb测定法，测定波长555nm。与手工法HiCN测定的相关性高（r=0.999）。手工法HiCN反应时间长，仅用于仪器的校准。有些血液分析仪测定血红蛋白，可兼用非氰化物试剂（如用二甲基月桂胺氧化物）和氰化物试剂（如用咪唑，含氰化物试剂作用，但无毒性）。,检 测 参 数
15、（报警）,1、报警的概念 是指所检测的标本不能满足仪器软件系统的定义或不能满足实验室（用户）建立的检测标准。 （1）报警来源：主要有检测结果超出实验室设定的检测项目参考值、复检标准，临床疾病标本异常和患者人群变异。 （2）报警形式：主要有图片、符号或文字三种。仪器依据预先设定的检测数据、大小分布、图形等，作出全面分析和判断，对可以的阳性检测结果用文字或图示的形式作出解释性、易于理解的报警信息。如，用红色显示阳性（反之，绿色显示阴性）。出现“阳性”或“错误”提示，可能确实是标本出现异常，因此必须根据实验室的规则，进一步仔细检查。特别须注意出现WBC、DC、RBC、PLT及其相关参数的数量和形态异
16、常的报警。,（3）报警有效性：仪器以参考方法检测结果作为标准，判断仪器检测性能指标，包括：灵敏度（S）、特异性（Sp）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和总数率（一致率或符合率）。 （4）报警内容：仪器报警的项目和内容是厂商和用户作出的定义，内容涉及检测对象年龄、性别、参考值、危急值、红细胞计数值、血小板计数值、白细胞计数和分类值、细胞形态或可疑的各种异常信息。血细胞分析仪解释性程序（IP）是仪器依据检测数据、大小分布、图形的全面分析作出判断，提供易于理解的报警信息，用于对结果显示和信息的补充，提示浏览屏幕上报警信息。 对同样的内容，各仪器报警形式并不统一。因此，要根据各仪器的操作手册，仔细理解定义。各类血细胞分析仪常见报警内容见表：,血细胞分析仪常见报警内容,2、标本因素 血细胞分析仪在检测性能上存在的共性问题是：在血细胞形态学方面，无论是白细胞五分类还是更多细胞分类，仍然不能替代人工显微镜检查对复杂的异常血细胞形态的识别能力。其原因除了血细胞分析仪检测技术上的局限性外，还受到疾病时标本中已存在的多
