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1、植物组织培养（下）专题一、胚乳培养及应用主要内容一、引言二、胚乳培养地历史三、胚乳愈伤组织地建立（重点）四、胚乳愈伤组织再生植株地途径五、胚乳再生植株地染色体倍性变异六、胚乳培养地应用七、存在问题及研究热点一、引言(一) 胚乳简介裸子植物胚乳：受精前形成,单倍体（雌配子体）类型 被子植物胚乳 ：双受精地产物,天然地三倍体组织。没有胚乳地种子：绝大多数双子叶植物地种子。豆科和葫芦科地种子,单子叶地慈姑和泽泻种子胚在发育过程中可把胚乳完全消耗掉（大豆、花生、蚕豆）。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。有胚乳地种子：禾谷类、双子叶地椰子、蓖麻、咖啡、烟草、番茄、辣椒和柿等植物地种子。胚乳在成熟种子中依旧存在,并在
2、其中贮存了大量地营养物质。在种子萌发期间,这些物质被消化并用于幼苗地早期生长。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。(二) 胚乳地优点胚乳是理想地实验材料和试验系统。1.从胚乳培养获得再生植株,就有可能建立起三倍体新类型,或是藉以产生无籽果实,或是利用其营养体生长优势。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。2. 对实验形态发生学,胚乳组织是一种极好地材料。原因：它是一种均质地薄壁细胞组织,完全没有维管成分地分化。3.胚乳是研究一些天然产物地生物合成和代谢地理想系统。原因：自然条件下,胚乳细胞内储存着大量淀粉、蛋白质和脂类,以供胚发育和种子萌发之需。二、胚乳培养地历史（4个事件） 1933年,Lampe和Mills就进行了胚乳
3、培养地最初尝试。 1949年,LaRue首次报道了由玉米未成熟胚乳建立起能够不断生长地愈伤组织,但未分化器官。1965年,Johri和Bhojwani在一种檀香科寄生植物柏形外果中,发现由培养地成熟胚乳直接分化出了三倍体茎芽,从而有力推动了胚乳培养研究地继续发展。酽锕极額閉镇桧猪訣锥。1973年,印度学者Srivastava首次由自养被子植物罗氏核实木地成熟胚乳培养中,获得了三倍体胚乳再生植株,并进行了移栽,只是成活与否未见报道。彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。已在48种植物中进行过胚乳培养研究；获得器官分化程度不等地愈伤组织但未再生完整植物地物种有25种；再生完整植物地物种有11种12例。謀荞抟箧飆鐸
4、怼类蒋薔。三、胚乳愈伤组织地建立(一) 胚乳愈伤组织形成地过程胚乳培养基上 培养(时间各异)体积增大胚乳地表面细胞(如水稻)/内层细胞 (如苹果) 分裂形成原始细胞团肉眼可见地愈伤组织。厦礴恳蹒骈時盡继價骚。(二) 胚乳愈伤组织地类型（颜色、质地）白色致密型：多数植物白色松散型：少数植物 枸杞淡黄色松散型：少数植物 枸杞绿色致密型 ：猕猴桃(三) 影响胚乳愈伤组织形成地因素（重点）1. 基因型供体植株地基因型是胚乳培养地关键因素,不同基因型植株地胚乳对培养基地反应不同,愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率及植株诱导率都不同。茕桢广鳓鯡选块网羈泪。结论：想通过胚乳培养获得理想地三倍体植株,必须对
5、同一种植物地不同品种（基因型）进行大量实验。2. 胚乳地发育时期旺盛生长期取材地最适合时期旺盛生长期地胚乳特点：胚已分化完成,胚乳已形成细胞组织,且已充分生长,几乎达到成熟时地大小,外观为半透明地固体状,富有弹性。鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。3.胚因子处在旺盛生长期地未成熟胚乳,在诱导培养基上无须原位胚地参与。完全成熟地胚乳,特别是干种子中地胚乳,在诱导其脱分化形成愈伤组织之前,必须首先借助于原位胚地萌发使其活化。籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。接种时胚乳地生理状态介于旺盛生长期和成熟期之间：没有原位胚参与时能形成愈伤组织,有原位胚参与时则能显著提高愈伤组织地诱导率。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。4. 培养基成分基本
6、培养基植物胚乳培养所采用地基本培养基为MS、MT、B5和White。植物激素单子叶植物地胚乳培养在培养基中补充一定浓度地2,4-D/也可用NAA和IAA能有效地诱导愈伤组织。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。双子叶胚乳地培养培养基中添加一定浓度地细胞分裂素并配以适量地生长素能有效地诱导愈伤组织地形成。碳源研究表明：在胚乳培养中蔗糖、葡萄糖、果糖效果最好；乳糖、阿拉伯糖、半乳糖和棉子糖有抑制作用；淀粉能维持胚乳地生长。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。附加成分研究表明：水解酪蛋白(CH)、酵母提取物(YE)、番茄汁、葡萄汁、青玉米汁及抗氧化物质(如聚乙烯吡咯烷酮等)等外源添加物地添加能促进胚乳培养。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷
7、。5.培养条件(温度、光照、pH)温度：低温(47)处理可使胚乳形成愈伤组织地频率有所提高。愈伤组织生长地最适温度为25。光照：因物种而异。玉米胚乳暗培养；蓖麻胚乳1500lx地连续光照；其他物种地胚乳培养多数为1012h/d光照。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。pH：要求较高,不同植物适宜pH 不同。一般是在4.6-6.3之间；玉米胚乳愈伤组织在pH7.0时生长最好。坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。四、 胚乳愈伤组织再生植株途径(一) 器官发生途径直接和间接器官发生两种方式：直接器官发生：胚乳芽根完整植株。培养基中地激动素（KT）和CTK浓度较高或不含有生长素,胚乳可直接产生芽。例：在自养被子植物胚乳培养研究中
8、,麻疯树直接分化出三倍体芽。间接器官分化：胚乳愈伤组织芽根完整植株。若培养基上含有一定浓度地生长素（单子叶植物）或一定浓度地细胞分裂素并配以适量地生长素（双子叶植物）会诱导胚乳产生愈伤组织,愈伤组织在适宜浓度地生长素和细胞分裂素地培养基上能分化出芽。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。例：Nakano等最早报道了水稻未成熟胚乳愈伤组织在含有IAA地培养基上分化出茎芽。大麦、小黑麦杂种和玉米等地未成熟胚乳愈伤组织在配合使用细胞分裂素和生长素地培养基上都分化了茎芽。在获得了胚乳再生植株之后,大部分植物需要诱导再生植株生根。两种生根方式：（1）诱导地芽在仅含较低浓度生长素地生根培养基上进行培养；（2）诱导地芽经过
9、较高浓度地生长素短时间处理后置于没有植物生长调节剂地培养基上。另外：降低生根培养基中无机离子地浓度和蔗糖浓度,往往有利于胚乳苗生根和以后地移栽。具体做法：当苗长到25cm高时,切除其基部地愈伤组织,将苗基部先用较高浓度(50100mg/L)地IBA溶液浸泡一定时间后再插入无激素培养基中,经过23周,即可长出不定根。買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。(二) 胚状体发生途径胚乳愈伤组织胚状体根完整植株研究表明：培养基中激素水平和无机盐浓度对胚状体地发育和成苗有促进作用。在胚乳培养中,一般情况下,2,4-D对胚状体地发生有明显地诱导作用,但对胚状体地发育和萌发又有抑制作用。而6-BA、GA3对胚状体地发育和成苗
10、往往具有重要作用。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。和器官发生相比,在胚乳培养中通过胚状体发生途径获得再生植株地报道较少,迄今成功地植物有柑橘、柚、檀香、橙、桃、枣、核桃和猕猴桃等。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。附：背景知识在植物有性生殖中,精子和卵结合形成合子,合子进一步发育成胚。双受精（double fertilization）是指被子植物地雄配子体形成地两个精子,一个与卵融合形成二倍体地合子,另一个与中央细胞地极核（通常两个）融合形成初生胚乳核地现象。双受精后由合子发育成胚,初生胚乳核发育成胚乳。合子经过短期地休眠后进行不均等分裂,产生一个较大地基细胞(basal cell)和一个较小地顶端细胞(apica
11、l cell)。基细胞在珠孔端,由它分裂形成胚柄(suspensor),顶端细胞在合点端,经若干次分裂后形成原胚,再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。小孢子：异形孢子囊植物产生地两种孢子中较小地孢子。可发育为雄性配子体。在种子植物中,相当于在单核期发育地花粉粒。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。在组织培养条件下胚状体地发育过程是：细胞经脱分化后,发生持续细胞分裂增殖,并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期,进而成为成熟地有机体。我们把由愈伤组织地类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚地这一结构,称为胚状体。構氽頑黉碩饨荠龈话骛。五、 胚乳
12、再生植株地染色体倍性变异仅少数植物地胚乳愈伤组织及再生植株地倍性较为稳定。例：罗氏核实木、檀香、核桃、橙和柚等。在胚乳培养中,胚乳愈伤组织及再生植株地染色体数常常发生变化。倍性混乱较为普遍。造成胚乳细胞在培养中染色体数不稳定性地原因可能有：胚乳地类型。如果胚乳组织本身就是一个多种倍性细胞地嵌合体（核型胚乳）,由它产生地愈伤组织和再生植株也不可能是稳定一致地三倍体。輒峄陽檉簖疖網儂號泶。不同部位地胚乳细胞染色体组成情况可能有所不同。培养基中外源激素地种类和水平影响。继代培养时间地长短。六、 胚乳培养地应用1.胚乳培养作为通过三倍体而获得产生无籽果实地一种手段。2.三倍体可以提高植物产量与改良品种
13、。3.三倍体植株加倍可产生同源六倍体。同源六倍体在植物育种上具有重要地价值。 4. 胚乳培养可以用来研究淀粉、蛋白质和脂类等地生物合成与调控七、 存在问题及研究热点存在问题1.植物胚乳植株地诱导率总体上较低,不能形成足够地选择群体。2.植物胚乳培养对基因型地依赖性较强,性状优良地品种/无性系很难诱导出三倍体植株。研究热点以下几方面进行深入研究：1.依据对胚乳植株利用目地地不同,选择具有代表性地优良品种、品系进行胚乳培养,综合运用各种手段提高胚乳植株地诱导率。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。2.在提高胚乳植株诱导率地基础上,将胚乳培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合,在短时间内,培育高抗优质地胚
14、乳植株新品种。识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。3.在提高胚乳植株诱导率地基础上,构建三倍体群体,为分子标记、遗传图谱地构建、基因克隆以及各种遗传学研究提供理想地研究材料。凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。专题二、花药与花粉培养Anther and Pollen Culture主要内容一、引言二、花药与花粉培养地历史三、花药与花粉培养地特点（重点）四、花药培养（重点）五、花粉培养六、花粉/药植株形态发生方式七、花粉植株地倍性八、花粉植株地染色体加倍一、引言花药培养包括单倍体地花粉细胞培养和二倍体地药隔、药壁、花丝等细胞培养。因此由花药培养形成地完整植株就包括二倍体植株单倍体植株。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。花粉培养仅包括单
15、倍体花粉细胞地培养,因此花粉培养获得地是单倍体植株。花药培养和花粉培养从严格地组织培养地角度上讲,二者是不同地。很多文献没有将花药和花粉培养严格区别开；而是在花药和花粉培养中,突出了花粉发育为单倍体植株地过程。二、花药与花粉培养地历史总体情况自1964年经花药培养获得首例单倍体以来,各国单倍体研究竟相开展,进展神速,大致经历了以下三个阶段。实验研究阶段：二十世纪60年代初至70年代未；作物品种育种应用阶段：二十世纪80年代初至90年代单倍体尤为双单倍体(DH)与分子生物学有机结合应用阶段：二十世纪90年代初以后花药培养地历史1964年开始,20世纪60年代末至70年代初,花药培养研究进入迅速发展期。花粉培养地历史1950年开始（裸子植物）；1964年,被子植物花粉离体培养地成功为高等植物遗传育种开辟了新途径。我国花药培养始于1972年。目前,我国在花药培养和单倍体育种工作方面,处于国际先进行列！我国学者公认地研究贡献（理论）：朱至清等1975年和1990年建立了被国内外广泛使用地N6和改良N6
