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1、免疫细胞（组织）化学技术 病理教研室 金晓明,主要讲述内容： 第一部分 免疫细胞化学的理论基础 第二部分 免疫荧光细胞化学技术 第三部分 免疫酶细胞化学技术 第四部分 免疫电子显微镜技术,第一部分 免疫细胞化学的理论基础 免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。,二、抗原决定簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。 类型：功能性抗原决定簇 隐蔽性抗原决定簇 免疫优势决定簇 线性或连续性决定簇 构象决定簇或不连续性决定簇 B 细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是免疫原性决定簇或连续性决定簇。
2、,三、抗原的性质与种类 （一）抗原的性质 1、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反应也更强。 自身抗原；自身抗体 2、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它抗原反应。,（二）抗原的种类方法 分类依据 种类 单独存在时是否有免疫原性 半抗原和完全抗原 抗原来源 外源性抗原和内源性抗原 抗原与宿主关系 异种抗原，同种异体抗原，自身抗原 B细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原 化学
3、物质 蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等 物理状态 颗粒性抗原，可溶性抗原 产生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原 抗原特异性程度 特异性抗原，共同抗原,完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质。 不完全抗原或半抗原：无免疫原性。,第二节 抗体（antibody） 一、抗体的概念 机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白。 二、抗体的性质和种类 （一）抗体的一般性质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,（二）免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质
4、，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。 （三）抗体的种类 1、根据抗体的途径或来源不同分为 免疫抗体；天然抗体；自身抗体 2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为 完全抗体；不完全抗体,三、抗原与抗体反应 称为免疫学反应。 在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应 四、抗体形成的机制 （一）免疫应答的产生 1、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段） 2、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段） 3、效应阶段（发生免疫反应阶段） （二）影响抗体产生的因素 1、抗原的质和量 2、机体方面 3、佐剂的增强免疫作用,第三节 有关基本技术
5、方法 一、抗体的制备 （一）抗体的制备方法 能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价多克隆和单克隆抗体。,1.多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯的抗体。 2.单克隆抗体：是1975年由Kohlenh Milstein发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb),单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较 特性 多克隆 单克隆 组
6、成 多种类抗体的混合物 单一种类的抗体 特异性 低 高 针对多个抗原决定族 针对单一的抗原决定族 亲和力 平均亲和力较高 不定，较低 交叉反应 高 低,（二）抗体的配制方法 1、抗体贮存 2、抗体使用液的配制,二、组织材料的处理 尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏 三、免疫染色 1、增强特异性染色方法 蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间 2、减少或消除非特异性染色方法 3、显色反应的控制 4、复染,四、对照 阳性对照；阴性对照 五、结果的判断 （一）阳性细胞的染色特性 1、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性 2、灶状和弥漫性 3、非特异性的认知 4、切片质量不佳出现的阳性要排除 （二）
7、染色失败的几种原因,第二部分 免疫荧光细胞化学技术 Coons等（1941）通过荧光标记抗体，并借助于荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。 近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的应用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光技术的新领域。,第一节 原理 一、基本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。 二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子载不断的运动着。 一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（
8、即基态） 在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级（即激发态），这个过程叫激发。,二、荧光素 1、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。 特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收 一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光 团。,2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件： 1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。 2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。 3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 4）与蛋白质结合的方法简便而快速。 5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。 6
9、）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。,3、荧光素的类型 1）异硫氰酸荧光素（fluorescien isothocyanate, FITC) 2）四甲基异硫氰酸罗达明（tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC) 3）四乙基罗达明（tetraethyl rhodamine, RB200) 4）其它,三、免疫荧光染色方法 1、直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。 优点：特异性高 缺点：一种荧光 抗体只能 检测一种 抗原。,2、间接法：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反应，随
10、后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原 抗体 荧光抗体的复合物。 优点：荧光亮度增强， 提高了敏感度,四、非特异性染色的消除方法 1、非特异性染色的主要因素 1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。 2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。 3）组织内类属抗原的存在。 4）从组织中难以提纯抗原性物质。 5）抗体分子上标记的荧光素太多。 6）荧光素不纯，标本固定不当。 7）细胞和组织内某些物质自发荧光。 8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。,2、消除的方法 1）衬染法（
11、可抑制自发荧光） 2）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光） 3）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色） 4）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光） 5）提高抗体和荧光抗体的质量,五、荧光显微镜及检测方法 略 六、染色标本的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。 用缓冲甘油封片，保存在4中，过夜后特异性荧光强度减弱25，保存1周后减弱60。,Nikon 荧光显微镜,肾活检（直接法）,肾活检（直接法）,肾活检（直接法） 低倍视野,肾活检（直接法），表达弱,肾活检（直接法）,肾活检（直接法）,左图：表达在细胞核（FITC）,右图：表达在胞膜,左图：DAPI 染色（
12、染核）,右图：,胃粘膜上皮细胞，胞浆胞膜阳性,血管内弹力膜阳性,胃腺癌,第三部分 免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法之一，它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，借助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原/抗体）组织细胞内存在部位的一门新技术。,第一节 免疫组织化学的基本技术 一、取材 1.实验动物 麻醉 （处死），锋利刀片切成大小适中，厚度3mm4mm。 小型实验动物：灌注（流）固定后取材 （生理盐水和4多聚甲醛） 2.人体材料 活检组织、手术标本、细胞和组织,二、固定 原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用 浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固
13、定时间一般为112h。 1.常用的固定剂 （1）甲醛缓冲液 广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h。,（2）4多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛应用于光镜细胞化学研究。 （3）戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。 （4）其它 如PLP液（过碘酸赖AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 类、锇酸等。,2.固定注意事项 （1）固定液的选择标准：A. 组织形态结构保存良好。 B. 最大限度保存抗原的抗原性。 （2）
14、组织块的大小：1.5cm1.5cm0.5cm为宜。 （3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。 （4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在4冰箱。 （5）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。,三、包埋 1.石蜡包埋 2.冷冻包埋 3.环氧树脂包理 四、切片 1.载玻片的处理 （1）清洗 （2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂： 明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。 多聚赖氨酸（PLL）。商品化粘附剂。,2.切片类型 （l）石蜡切片 厚约3 5m，放置37温箱烘烤过夜，以减少脱片。 （2）冷冻切片：2m。 （3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要
15、用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。,第二节 免疫组化染色过程中基本技术 一、蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限度地结合增强特异性染色。 1.常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶 2.消化时间 因组织而异，一般为530min，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。,3.非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。 （1）原因分析 组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等. 试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。 （2）消除方法 加1抗前加正常血清1030min，以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非特异性结合。,减少非特异性染色： a.免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30min（3%的H2O2甲醇溶液处理510min）。 b.免疫荧光染色时，可用0.010.05伊文思蓝稀释荧光抗体。 二、对照 阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片：确认不含己知抗原的
