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1、第三章 细胞生物学研究方法,概论 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,概论,对实验技术的依赖性 显微镜细胞学，奠基性作用 电镜与生物化学及分子生物学结合细胞生物学，决定性作用,BACK,第一节 细胞形态结构的观察方法, 光学显微镜技术(light microscopy） 0.2 m 电子显微镜技术(Electro microscopy) 0.2nm 扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope) 3nm, 0.7nm 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope) （侧0.1-0.2，纵0.001n
2、m）,BACK,光学显微镜技术,普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 激光共焦点扫描显微镜技术 相差和微分干涉显微镜技术,BACK,普通复式光学显微镜技术,光镜样本制作 显微镜组成 光学放大系统 照明系统 机械和支架系统,普通复式光学显微镜技术,分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 当max=140, min=450nm ， 空气N=1， D=292nm0.3 m 水N=1.33，D=219.6nm 0.22 m 香柏油 N=1.5， D=292nm 0.2 m (普通光镜最大分辨率, 光衍射限制),荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy),原理与应用 直接荧光标记技
3、术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy),原理：以紫外线为光源，照射被检测物体发出荧光后，在显微镜下观察其形状及位置仪器 自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基绿、吖啶橙) 优点： 多种成分定位 只有激发荧光可成像，敏感度高 染色简便 标本呈彩色图像 固定细胞和活细胞,数字成像显微技术,图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经计算机放大、假信号减弱或消除,暗场显微技术,明视野局限性 具颜色，吸收或折射随机光 暗
4、场 通过样品进入成像系统的仅折射光或衍射光 微生物计数 放射自显影的银颗粒观察 分辨率低,激光共焦扫描显微镜技术(Laser Scanning Confocal Microscopy),原理：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构 激光共焦点扫描显微镜 共焦点(物镜和聚光镜同时共聚焦) 自动改变焦平面 纵向分辨axial resolution,相差(phase-contrast) 显微镜技术,原理 光线通过不同密度物质时，滞留程度不同，该显微镜将这种光程差或相位差转换成振幅差 构造 相差板，再次放大相位差，再经透镜聚集、叠加或抵消干涉，明暗区别明
5、显 优点 活细胞，细胞核或线粒体动态,微分干涉(differential-interference)显微镜技术,原理 平面偏振光经棱镜折射分成两束，不同时间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜汇合，使样品厚度的微小差别转换成明暗区别 优点 增加样品反差和立体感 可观察活细胞中较大细胞器 与录象机连接，活细胞中颗粒及细胞器运动 用计算机辅助，更精细结构,电子显微镜的基本知识 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 电子显微镜的分辨率与有效放大倍数 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术介绍 超薄切片技术 负染色技术 冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术 电镜三维重构技术 扫描电镜技术,电子显微镜技术,BACK,电子
6、显微镜与光学显微镜的基本区别, 光源: 波长0.1nm电子束 棱镜：电磁透镜 镜筒环境：高真空 图象显示：荧光屏或感光胶片,电子显微镜的分辨率与有效放大倍数,人眼：0.2mm 光镜：0.2 m，放大1000倍 电镜：0.2nm，放大1000000倍 有效放大与无效放大 电镜的分辨率与分辨本领(处于最佳状态下的分辨率)，超薄切片的1/10,电子显微镜的基本构造, 电子束照明系统 电子枪、聚光镜 成像系统 物镜、中间镜与投影镜 真空系统 电子枪、镜筒及记录系统 记录系统 荧光屏、感光胶片,电镜与光镜光路图比较,电镜与光镜的比较,超薄切片技术Ultrathin section,制样要求：样品很薄；完
7、好保持其精细结构，40-50 nm，即d为20 m细胞可切几百片，需刚性、韧性 固定：OsO4、戊二醛、KMnO4、高频微波(低温、快速、样块不宜太大) 包埋：完整、耐干燥、电子轰击和真空挥发，环氧树脂(包埋剂要求) 切片 染色：锇酸染脂肪，铅盐染蛋白质，醋酸铀染核酸,负染色技术negative staining,生物大分子(病毒、线粒体基粒、核糖体、蛋白纤维)精细结构 分辨率：1.5 nm 磷钨酸或醋酸双氧铀 机理：未知,Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a
8、tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).,冷冻断裂(fracturing)和冷冻蚀刻(etching)电镜技术, 原理：快速低温冷冻使样品从结构相对“脆弱”部位 (磷脂双分子层疏水端)断裂，显示镶嵌在脂膜中的蛋白质颗粒，冰在真空升华，可增强“浮雕”式蚀刻效果 膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面，富立体感，不需包埋，固定，很好保持真实性 冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)：细胞骨架
9、纤维及结合蛋白,电镜三维重构技术,电子显微镜技术、电子衍射与计算机图像处理相结合，适于难形成三维晶体膜蛋白、病毒和蛋白质-核酸复合物三维结构 A.Klug 技术，一系列电镜照片经傅里叶变换得到大分子电子密度图 低温电镜技术(cryoelectron microscopy)：直接冰膜包埋，在-160C制样台利用相位衬度成像 电镜三维重构技术与X射线晶体及核磁共振技术，当前结构生物学主要实验手段,扫描电镜Scanning electron microscope,电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集、转换、放大二次电子成象 CO 2临界点干燥法，解决引起样品变形的表面张力问题 景深
10、长，具强烈立体感 不能观察活样品和细胞全貌,扫描隧道显微镜Scanning tunneling microscope,1981年，IBM苏黎世实验室的Binnig，Rohrer，Gerber和Weible发明的，探测微观世界物质表面形貌的仪器 统称扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope, SPM):包括STM、AFM (atomic force microscope)、磁力显微镜、摩擦力显微镜等,BACK,扫描遂道显微镜原理,量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠) 当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电流(隧道电流)，且Ie
11、xp(-2Kd)，d为针尖与样品间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定 扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等,扫描遂道显微镜,特点 (1)对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，具高分辨(侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率达0.01nm) (2) 得到三维图象，可测量厚度信息 (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性 (4)可连续成像，进行动态观察 用途 DNA、RNA、蛋白质、病毒等生物大分子结构；纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构,第二节 细胞组分的分析方法,离心
12、分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术,用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物, 差速离心(differential centrifugation) 沉降系数S与大小和形状有关 密度梯度离心,BACK,细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法, DNA：Feulgen反应，酸除去RNA和DNA上的嘌呤脱氧核苷酸，使其醛基暴露，自由醛基再通过Schiff试剂反应呈紫红色 多糖：PAS反应，同上原理使希夫试剂与醛基反应，但多糖先被过碘酸氧化 脂肪：四氧化锇，苏丹III，苏丹黑
13、蛋白质：Millon反应，氮汞试剂与蛋白质侧链酪氨酸残基反应，成红色沉淀；重氮反应中，氢氧化重氮与Tyr，Ser和His反应成有色复合物,BACK,特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术 免疫酶标记技术 蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术,特异蛋白质抗原的定位与定性, 20th70年代，免疫学兴起，为特异蛋白的定性定位提供了极重要手段 免疫荧光技术Immunofluo-rescence technigue：免疫学与荧光标记技术，荧光抗体制备，标本处理，免疫染色，观察记录 缺点： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限,BACK,特异蛋白质抗原的定
14、位与定性,免疫酶标记技术，酶代替荧光素与抗体偶联 免疫电镜技术 免疫铁蛋白技术：淘汰状态 免疫酶标技术： 免疫胶体金技术：易识别、高分辨率、多重标记、超薄切片、装配成分 应用：分泌蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术 in situ hybridization （同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 分子水平的原位杂交技术 (PCR技术),BACK,利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,放射自显影技术：利用放射性同位素电离辐射对乳胶
15、的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性定位与半定量研究的技术 追踪 DNA：3H-TdR RNA： 3H-U 蛋白质：35S 标记Met和 Cys，3H 或14C标记Met和Leu等,利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,步骤 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 常规制片 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) 暗盒暴光或自显影 显影、定影、观察 与显微自显影区别 敷胶要单层晶体 暴光时间长,定量细胞化学分析技术, 细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞内的含量 包括： 紫外光显微分
16、光光度测定法 可见光显微分光光度测定法,BACK,定量细胞化学分析技术,流式细胞仪(Flow Cytometry) 分散群体细胞对待测成分染色悬液通过细胞仪 主要应用： 定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量 测定细胞群体中不同时相细胞的数量 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞 分离DNA含量不同的中期染色体,第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,细胞培养 动物细胞培养 植物细胞培养 非细胞体系在细胞生物学研究中的作用 细胞工程 细胞融合与细胞杂交技术 单克隆抗体技术 细胞拆合与显微操作技术,BACK,细胞的培养,动物细胞培养 类型：原代培养细胞(primary culture cell) (110代) 继代培养细胞(sub-culture cell)(10代后) 细胞株(cell strain):1040(50)代 细胞系(cell line): 50代后 类型: 成纤维样细胞fibroblast like cell 上皮样细胞epithelial like
