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1、.,1,遗传代谢病简介,基因突变导致维持机体正常代谢所必需的某些酶、受体或载体等缺乏发生的疾病 多为单基因遗传病 大部分属于常染色体隐形遗传病，部分属于伴性遗传 遗传代谢病病种繁多，目前已发现近3000余，单病发病率低，但总体发病率可达活产婴儿的1/500,.,2,遗传代谢病发病机制,正常代谢途径,代谢物（A）,代谢物（B）,X,酶,代谢物（A1）,代谢物（A2）,异常代谢途径,辅酶（C）,代谢物（C1）,代谢物（C2）,代谢物（B1）,代谢物（B2）,.,3,遗传代谢病的分类,氨基酸代谢病：苯丙酮尿症、枫糖尿病、酪氨酸血症、同型胱氨酸尿症、非酮性高甘氨酸血症 尿素循环障碍：鸟氨酸氨甲酰转移酶
2、缺乏症、瓜氨酸血症、精氨酸琥珀酸血症、精氨酸血症 有机酸代谢病：甲基丙二酸血症、丙酸血症、异戊酸血症、戊二酸血症、多种羧化酶缺乏症等 脂肪酸代谢（氧化）病：短链、中链、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症，原发性肉碱缺乏症等 糖代谢病：糖原累积病、G6PD缺乏症、半乳糖血症等 溶酶体贮积症：粘多糖病、戈谢病、尼曼皮克病等 其他：先天性肾上腺皮质增生症、肝豆状核变性等,.,4,串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MS/MS）,质谱仪：通过检测物质的质量与电荷比（m/z），对物质进行定性和定量的分析仪器 串联质谱仪：有两个质谱串联而成的二级质谱,.,5,串联质谱遗传代谢病检测样
3、品处理方法-衍生法,3mm(3.2ul全血)血滤纸片（96孔过滤板）,100ul甲醇（含内标），轻摇20min(萃取),离心至另一96孔聚丙烯板,55吹干 60ul盐酸正丁醇，65,15min（衍生，丁酯化）,55吹干,100ul乙腈：水（80:20）,上机进样（每次20ul）检测 （2min检测1个样品）,.,6,串联质谱检测结果,检测60余种氨基酸和酰基肉碱 可设置40余个氨基酸或酰基肉碱之间的比值 筛查或检测45种疾病 国际：1991年（美国） 国内：2002年（新华医院，儿研所）,.,7,血氨基酸检测结果,血氨基酸增高：,不同氨基酸增高，可代表一种疾病或几种疾病 一种疾病可有多种氨基酸
4、增高,血氨基酸降低：,多继发于营养不良（蛋氨酸及瓜氨酸除外）,.,8,苯丙氨酸增高（Phe、Phe/Tyr）,高苯丙氨酸血症（单纯Phe增高） 希特林蛋白缺乏症（同时Cit、Met增高） 酪氨酸血症（同时Tyr增高） 静滴氨基酸（伴多种氨基酸增高）,.,9,高苯丙氨酸血症（HPA）,发病机制：,苯丙氨酸（Phe）,酪氨酸（Tyr）,苯丙氨酸羟化酶,X,四氢生物蝶呤（BH4）,苯丙酮酸,多巴,苯乙酸,苯乳酸,黑色素,多巴胺,肾上腺素,患病率：1:10,000,.,10,酪氨酸增高（Tyr、Tyr/Phe）,酪氨酸血症I，II，III型 希特林蛋白缺乏症（同时Cit、Met增高） 甲基丙二酸血症（
5、同时C3、C3/C2增高） 继发于肝功能损伤 新生儿暂时性酪氨酸血症（筛查发现）,.,11,酪氨酸,酪氨酸血症,4-羟-苯丙酮酸,发病机制,4-羟苯乳酸,4-羟苯乙酸,尿黑酸,马来酰乙酰乙酸,延胡索酸乙酰乙酸,乙酰乙酸,延胡索酸,琥珀酸乙酰乙酸,琥珀酰丙酮,I 型,酪氨酸氨基转移酶,4-羟-苯丙酮酸过氧化物酶,尿黑酸氧化酶,延胡索酸乙酰乙酸水解酶,x,II型,III型,x,x,X,尿黑酸尿症,.,12,蛋氨酸增高（Met、Met/Phe）,希特林蛋白缺乏症（同时Cit增高） 同型半胱氨酸血症（血同型半胱氨酸增高） 高蛋氨酸血症 酪氨酸血症（同时Tyr增高） 继发于肝功能损伤,.,13,瓜氨酸增
6、高（Cit、Cit/Arg、Cit/Phe）,希特林蛋白缺乏症（同时Met、Tyr增高） 瓜氨酸血症-I型（血氨显著增高） 精氨琥珀酸尿症,.,14,精氨酸增高（Arg、Ayg/Orn、Arg/Phe）,希特林蛋白缺乏症（同时Cit、Met增高） 精氨酸血症 溶血,.,15,亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸增高（Leu、Leu/Phe）,枫糖尿病 继发于早产儿,.,16,枫糖尿病,发病机制 E1：decarboxylase（羟色氨酸脱羧酶），E2：acyl transferase； E3：flavoprotein lipoamide dehydrogenase（黄素蛋白2-氧（代）异戊酸脱氢酶）,亮氨
7、酸,2-酮异已酸,异戊酰-CoA,支链-酮酸脱氢酶（BCKD）复合体,X,异亮氨酸,2-酮-3-甲基戊酸,2-甲酰丁酰-CoA,X,支链-酮酸脱氢酶（BCKB）复合体,缬氨酸,2-酮异戊酸,异丁酰-CoA,X,支链-酮酸脱氢酶（BCKB）复合体,.,17,丙氨酸及甘氨酸增高,丙氨酸：线粒体疾病：肝大，乳酸增高，低血糖 甘氨酸：非酮性高甘氨酸血症，丙酸血症，MMA,.,18,血氨基酸检测结果降低,瓜氨酸降低 鸟氨酸氨基甲酰转氨酶缺乏症（尿乳清酸及尿嘧啶增高） 氨甲酰磷酸合成酶缺乏症 蛋氨酸降低 甲基丙二酸血症（cbl C型多见） 同型半胱氨酸血症 多种氨基酸降低：继发于营养不良,.,19,甲基丙
8、二酸血症发病机制,甲基丙二酰辅酶A,甲基丙二酰CoA变位酶,琥珀酰辅酶A,腺苷钴胺素,钴胺素腺苷转移酶,cblB,CbI ,钴胺素还原酶,cblA，cblH,溶酶体,CbI ,CbI ,cblC,cbID,甲基钴胺素,蛋氨酸合成酶，cbIE,同型半胱氨酸,蛋氨酸,X,蛋氨酸合成酶，cbIG,线粒体,X,.,20,血游离肉碱及酰基肉碱 检测结果解读,.,21,游离肉碱及酰基肉碱的生理功能,促进脂肪氧化代谢：与酰基辅酶A结合成酰基肉碱，协助中长链脂肪酸进入线粒体内进行氧化，为细胞提供能量，尤其是在饥饿、应激时 与其他酰基辅酶A结合成酰基肉碱，协助有机酸代谢 促进丙氨酸代谢，减少乳酸在肌肉中的堆积
9、维持体液中酰基COA的水平，以利于各种代谢 与体内过多酰基CoA结合成酰基肉碱，进入肝肾代谢，以防体内酰基CoA过多，造成毒性,.,22,游离肉碱及酰基肉碱检测结果解读,游离肉碱及酰基肉碱增高 不同酰基肉碱增高，可代表一种疾病或几种疾病 一种疾病可能有多种酰基肉碱增高 游离肉碱及酰基肉碱降低 多为继发于营养不良（游离肉碱除外）,.,23,有机酸血症相关酰基肉碱（短链酰基肉碱）,C3：丙酰肉碱 C3DC：丙二酰肉碱 C4：丁酰肉碱 C4OH：3-羟基丁酰肉碱 C5：异戊酰肉碱 C5OH：3-羟基异戊酰肉碱 C5DC：戊二酰肉碱 C5:1:异戊烯酰肉碱,.,24,发病机制,有机酸血症,亮氨酸,异亮
10、氨酸,缬氨酸,2-氧代异乙酸,2-氧代-3-甲基戊酸,2-氧代异戊酸,异戊酰CoA,2-甲基丁酰CoA,异丁酰CoA,3-甲基巴豆酰CoA,甲基巴豆酰CoA,甲丙烯酰CoA,3-甲基戊烯二酰CoA,2-甲基-3-羟基丁酰CoA,3-羟异丁酰CoA,3-羟-3-甲基戊二酰CoA,2-甲基-3-氧代丁酰CoA,丙酰CoA,乙酰乙酸,乙酰CoA,甲基丙二酸CoA,琥珀酰CoA,钴胺素,同型胱氨酸,蛋氨酸,生物胞素,生物素,丙酮酸,草酰乙酸,X,X,X,X,X,X,X,X,X,X,X,X,X,枫糖尿病,.,25,丙酰肉碱增高（C3、C3/C2）,甲基丙二酸血症（常伴Met降低） 丙酸血症（常伴Gly增
11、高） 多种羟化酶缺乏症（伴C5-OH显著增高） 继发于酸中毒,.,26,丁酰肉碱增高（C4、C4/C3）,短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 乙基丙二酸脑病 异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症,.,27,异戊酰肉碱增高（C5、C5/C2）,异戊酸血症（尿异戊酰甘氨酸增高） 继发于丙戊酸类药物使用 继发于特戊酸盐类抗生素（头孢类药物）,.,28,戊二酰碱增高（C5DC、C5DC/C2、C5DC/C8）,戊二酸血症-I型（不伴有其他酰基肉碱增高） 戊二酸血症-II型（伴其他多种酰基肉碱增高）,色氨酸,赖氨酸,酵母氨酸,2-氨基已二烯半醛,2-氨基已二半醛,2-氧代已二酸,戊二酰CoA,戊二酸,戊二酰肉碱,GA-I,
12、戊二酰CoA 脱氢酶,戊烯二酰CoA,巴豆酰CoA,3-羟戊烯二酸,.,29,3-羟基异戊酰肉碱增高（C5-OH、C5-OH/C3）,多种羟化酶缺乏症（生物素酶缺乏症，醛缩化酶合成酶缺乏症） 3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症 3-羟-3-甲基戊二酸尿症 3-甲基戊烯二酸尿症 丙酸血症（伴C3显著增高）,.,30,脂肪酸氧化代谢病相关酰基肉碱（中链、长链酰基肉碱）,C0：游离肉碱 C8：辛酰肉碱 C10：葵酰肉碱 C12：月桂酰肉碱 C14：肉豆蔻酰基肉碱 C14:1：肉豆蔻烯酰基肉碱 C16：棕榈酰基肉碱 C16OH：3-羟基棕榈酰基肉碱 C18：十八碳酰基肉碱 C18OH：3-羟基十八碳酰基
13、肉碱,.,31,线粒体脂肪酸-氧化代谢途径,细胞膜,胞浆,肉碱转运蛋白,脂肪酸,肉碱,肉碱,C12-C16,注：小于C8的脂肪酸不需肉碱传递？,.,32,游离肉碱C0、C0/(C16+C18), C0增高,肉碱棕榈酰转移酶-I缺乏症（其他酰基肉碱正常，或降低） 继发于肝功能损伤（伴其他多种酰基肉碱增高） 静滴或口服左旋肉碱, C0降低,原发性肉碱缺乏症（伴多种酰基肉碱降低） 继发于营养不良，有机酸血症，脂肪酸氧化代谢病，母源性肉碱缺乏症,.,33,辛酰肉碱增高（C8、C8/C3）,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 （C8增高，C10正常，C8/C10增高）,多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 （C8、C10
14、均增高，C8/C10正常）,.,34,多种酰基肉碱增高（C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18）,多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 肉碱棕榈酰转移酶-II缺乏症 肉碱/酰基肉碱移位酶缺乏症 继发于肝功损伤（伴C0、C2增高）,.,35,肉豆蔻烯酰肉碱增高（C14:1、C14:1/C8:1、C14:1/C16）,极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（C14:1增高为主）,多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症,.,36,3-羟基棕榈酰肉碱增高（C16-OH、C16-OH/C3）,极长链3-羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症,.,37,进行了串联质谱检测， 为何还要进行气相色谱质谱检测？,.,
15、38,串联质谱检测的部分疾病需要气相质谱验证及鉴别,.,39,气相质谱检测疾病串联质谱检测血结果正常,鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症：尿乳清酸、尿嘧啶增高 甘油激酶缺乏症：尿甘油酸显著增高 海绵体状脑白质病变营养不良：N-乙酰天冬氨酸 尿黑酸尿症：尿黑酸显著增高 甲羟戊酸尿症：甲羟戊酸增高 延胡索酸尿症:延胡索酸增高,.,40,GC-MS在遗传代谢病检测中的应用,应用现状：国际（日本，1966）；国内（华中科技大，同济医院，2003） 应用步骤：样品处理，GC-MS检测、结果分析判断 检测的疾病：30-40种,.,41,尿液前处理方法,取相当于0.2mg肌酐的尿样，加入尿素酶20ul混匀，37 温育
16、30min,加入托品酸、17烷酸、24烷酸各40ug 加入5%盐酸羟铵500ul、2.5N氢氧化钠400ul，调PH12-14混匀，室温静置60min,加入60N盐酸350ul，混匀，调PH1.0，离心，取上清液,加入乙酸乙酯5ml，混匀，离心，分取上清液，重复3次，离心3000转，5分钟,加入无水硫酸钠5g，混匀，离心3000转，5min，取上清液，60 用氮气仪吹干,加入BSTFA与TMCS混合物100ul，80 ,30min（总时间：6h）,1ulQP2010GCMS,.,42,半定量分析-Screen软件,定性：依据保留时间（色谱）和参考离子（2个，质谱） 定量原理：依据内标17-烷酸的量，通过检测物的封面积与17-烷酸的峰面积比 定量性质：半定量 定量种类：134种有机酸，其中2种为内标 定量表达形式：文本格式,.,43,气相质谱检测
