第三节：氧化磷酸化课件

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1、第三节 氧化磷酸化,一、概念 二、氧化磷酸化偶联部位及P/O比 三、氧化磷酸化机理 四、氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂 五、线粒体穿梭系统 六、氧化磷酸化的调控,一、概念,生物体内高能磷酸化合物ATP的生成主要由三种方式： 氧化磷酸化 底物水平磷酸化 光合磷酸化,底物水平磷酸化指ATP的形成直接与一个代谢中间物（PEP）上的磷酸基团转移相偶联的作用。,1、底物水平磷酸化,特点：ATP的形成直接与中间代谢物进行的反应相偶联；在有 O2或无O2条件下均可发生底物水平的磷酸化。,是与电子传递过程偶联的磷酸化过程。即伴随电 子从底物到O2的传递，ADP被磷酸化生成ATP的酶促过程，这种氧化与磷酸化相偶联

2、的作用称为氧化磷酸化。 这是需氧生物合成ATP的主要途径。 真核生物的电子传递和氧化磷酸化均在线粒体内膜上进行。原核生物则在质膜上进行。,2、氧化磷酸化,1、P/O比： 1940年，S Ochoa测定了在呼吸链中O2的消耗与ATP生成的关系，为此提出P/O比的概念。（同位素实验） 当一对电子经呼吸链传给O2的过程中所产生的ATP分子数。实质是伴随ADP磷酸化所消耗的无机磷酸的分子数与消耗分子氧的氧原子数之比,称为P/O比。 线粒体NADH+H+经呼吸链氧化P/O比为2.5（3），FADH2经呼吸链氧化P/O比为1.5（2）。,二、氧化磷酸化偶联部位及P/O比,2、形成ATP的部位（氧化与磷酸化

3、偶联部位）,电子传递链将NADH和FADH2上的电子传递给氧的过程中释放自由能，供给ATP的合成。其中释放大量自由能的部位有3处，即复合物、 ，这3个部位就是ATP合成的部位，称为偶联部位。,关于论证ATP形成部位的实验证据： （1）G0 =-nF E0 ,（2） 琥珀酸氧化P/O=2，苹果酸氧化P/O=3 表明在NADHCoQ 有一次磷酸化作用,（3）A.Lehninger用抗坏血酸使电子从细胞色素C进入 呼吸链，测得P/O=1，说明由cytaa3O2有一次 磷酸化,（4）使用专一性电子传递链抑制剂亦可测出ATP的形 成部位（举例）,能量计算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，总反应为：NA

4、DH+H+1/2O2,NAD+H2O,求此反应的G0 ： 因为：1/2O2+2H+2e-,H2O , E0 =0.82v,NAD+2H+2e-,NADH+H+, E0 =-0.32v,所以： E0=0.82-(-0.32)=1.14V G0 =-2X23.063X1.14=-52.6(Kcal/mol) =-220(KJ/mol),3ADP+Pi 3ATP+3H2O G0 =3X7.3=21.9 (Kcal/mol)=91.6 (KJ/mol) 3个ATP的形成共截获的能量为41%,1、有关氧化磷酸化机理的几种假说 化学偶联假说 构象偶联假说 化学渗透假说,三、氧化磷酸化作用的机理,（1）化学

5、偶联假说（1953年）（掌握要点） chemical coupling hypothesis 认为电子传递反应释放的能量通过一系列连续的化学反应形成高能共价中间物，最后将其能量转移到ADP中形成ATP。 AH2+B+I-OH A I+BH2+OH- A I+X-H+OH- X I+A+H2O X I+P-OH X P+I-OH X P+ADP ATP+X-H AH2+B+ADP+P-OH A+BH2+ATP+H2O,（2）构象偶联假说（1964） conformational coupling hypothesis 认为电子沿电子传递链传递使线粒体内膜的蛋白质组分发生了构象变化，形成一种高能构

6、象，这种高能形式通过ATP的合成而恢复其原来的构象。 迄今未能分离出这种高能蛋白质。但在电子传递过程中蛋白质组分的构象变化还是存在的。,（3）化学渗透假说（1961） chemiosmotic hypothesis,1961年由英国生物化学家Peter Mitchell最先提出。 认为电子传递释放的自由能和ATP的合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。即电子传递释放的自由能驱动H+从线粒体基质跨过内膜进入膜间隙，从而形成跨线粒体内膜的H+离子梯度，及一个电位梯度。这个跨膜的电化学电势驱动ATP的合成。,NADH呼吸链中的三个复合物、起着质子泵的作用，将H+ 从线粒体基质跨过内膜进入膜间隙

7、。 H+不断从内膜内侧泵至内膜外侧，而又不能自由返回内膜内侧，从而在内膜两侧建立起质子浓度梯度和电位梯度即电化学梯度，也称为质子动力。 当存在足够的跨膜电化学梯度时，强大的质子流通过嵌在线粒体内膜的F0F1-ATP合酶返回基质，质子电化学梯度蕴藏的自由能释放，推动ATP的合成。,化学渗透假说示意图,获得1978年的诺贝尔化学奖,支持化学渗透假说的实验证据：,氧化磷酸化作用的进行需要封闭的线粒体内膜存在。 线粒体内膜对H+ OH- K+ Cl-都是不通透的。 破坏H+ 浓度梯度的形成（用解偶联剂或离子载体抑制剂）必然破坏氧化磷酸化作用的进行。 线粒体的电子传递所形成的电子流能够将H+ 从线粒体内

8、膜逐出到线粒体膜间隙。 大量直接或间接的实验证明膜表面能够滞留大量质子，并且在一定条件下质子能够沿膜表面迅速转移。 迄今未能在电子传递过程中分离出一个与ATP形成有关的高能中间化合物，亦未能分离出电子传递体的高能存在形式。 H+如何通过电子传递链“泵”出的？,关于H+通过电子传递链“泵”出的两种假设 （一般了解）,氧化-还原回路机制 ( Mitchell提出）：线粒体内膜呼吸链的各个氧-还中心即FMN CoQ CytC以及Fe-S中心的排列可能即执行电子转移又能转移基质的质子。但是在电子传递链中，（H +e-）载体只有两个即FMN CoQ，则三个ATP合成部位中还缺少一个 （H +e-）载体，

9、假设CoQ发挥两次作用。（Q循环）,质子泵机制：电子传递导致复合体的构象变化，而造成AA侧链pK 的变化，发挥质子泵作用的侧链暴露在内膜内侧或外侧（交替变化），从而使质子发生移位。,线粒体内膜的表面有一层规则地间隔排列着的球状颗粒，称为FOF1-ATP合酶，也叫ATP合酶复合体或ATP合酶，是ATP合成的场所。 它由FO、F1两部分组成，其中FO由4种6条不同的肽链组成，是复合体的柄（含质子通道），镶嵌到内膜中.F1由5种9条肽链组成，呈球状，是复合体的头，与FO结合后这个头伸向膜内基质。 FO是膜外质子返回膜内的通道，F1是催化ATP合成的部位，当膜外的质子经FO质子通道到达F1时便推动AT

10、P的合成。,ATP的合成机制 FOF1-ATP合酶,亚线粒体结构证明FOF1-ATP合酶中FOF1的功能,1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重组实验：,超声波,胰蛋白酶 或尿素,重组,亚线粒体囊泡,有电子传递能力 但不能使ADP磷酸化,具备氧化磷酸化能力,根据当前最新测定, H+经NADH-Q还原酶、细胞色素bc1复合体（ ）、细胞色素氧化酶（复合体）从基质泵到膜外时，一对电子泵出的质子数依次为4、2、4，而合成一个ATP分子是由3个H+通过ATP合酶所驱动。所以电子从NADH传至O2，共产生的ATP分子数是2.5个 若从琥珀酸传递至O2，只有两个偶联部位，产生1.5个ATP。,Fe-

11、S FADH2,琥珀酸-Q还原酶 （复合体 ）,1、解偶联剂（uncouplers） 某些化合物能消除跨膜的质子浓度梯度或电位梯度，使ATP不能合成，这种作用称为解偶联作用，这类化合物成为解偶联剂。 解偶联剂不抑制电子传递。不抑制底物水平的磷酸化。 解偶联剂主要有三种类型： 化学解偶联剂：2、4-二硝基苯酚 离子载体： 解偶联蛋白：,不同的化学因素对氧化磷酸化作用的影响方式不同，据此将它们分成三大类：,四、氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂,化学解偶联剂：2、4-二硝基苯酚 （2、4-dinitrophenol,DNP）,DNP在pH=7的环境中以解离形式存在，是脂不溶的，不能过膜。 在酸性环境中接

12、受H+,成为不解离形式，是脂溶性的，很容易过膜，同时将H+带入膜内，起消除质子浓度梯度的作用。亦称质子载体。 起同样作用的有三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP）。,中性环境,酸性环境,离子载体（离子载体抑制剂）,是一类脂溶性物质，能与H+以外的其他一价阳离子结合，并作为他们的载体使他们能过穿过膜，消除跨膜的电位梯度。 缬氨霉素（K+） 短杆菌肽（K+ Na+）,解偶联蛋白（产热素）,是存在于某些生物细胞线粒体内膜上的蛋白质，为天然解偶联剂。 它们能形成质子通道，让膜外的H+通过通道返回膜内，消除跨膜质子浓度梯度。 如：动物的褐色脂肪组织，其产热机制 是线粒体氧化磷酸化解偶联的结果。 人、新生无

13、毛的哺乳动物以及冬眠的哺乳动物。,1、有关氧化磷酸化机理的几种假说 化学偶联假说 构象偶联假说 化学渗透假说,三、氧化磷酸化作用的机理,NADH呼吸链中的三个复合物、起着质子泵的作用，将H+ 从线粒体基质跨过内膜进入膜间隙。 H+不断从内膜内侧泵至内膜外侧，而又不能自由返回内膜内侧，从而在内膜两侧建立起质子浓度梯度和电位梯度即电化学梯度，也称为质子动力。 当存在足够的跨膜电化学梯度时，强大的质子流通过嵌在线粒体内膜的F0F1-ATP合酶返回基质，质子电化学梯度蕴藏的自由能释放，推动ATP的合成。,化学渗透假说示意图,获得1978年的诺贝尔化学奖,1、解偶联剂（uncouplers） 某些化合物

14、能消除跨膜的质子浓度梯度或电位梯度，使ATP不能合成，这种作用称为解偶联作用，这类化合物成为解偶联剂。 解偶联剂不抑制电子传递。不抑制底物水平的磷酸化。 解偶联剂主要有三种类型： 化学解偶联剂：2、4-二硝基苯酚 离子载体： 解偶联蛋白：,不同的化学因素对氧化磷酸化作用的影响方式不同，据此将它们分成三大类：,四、氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂,直接作用于ATP合酶复合体而抑制ATP合成的一类化合物。 由于影响（降低）O2的利用率，从而间接抑制电子传递。（区别于电子传递链抑制剂） 寡霉素、双环己基碳二亚胺（抑制FOF1某些蛋白的活性） 寡霉素等对利用氧的抑制作用可被DNP解除。,2、抑制剂,线粒体

15、呼吸的5种状态（B.Chance and G R Williams）,悬浮的线粒体实验： 状态I：无底物和ADP； 状态II：只有ADP 状态III：有底物和ADP 状态IV：有底物和加入的ADP 状态V：氧被耗尽时，线粒体 呼吸停止。,寡霉素对氧消耗的抑制以及DNP解除寡霉素的抑制作用：,真核细胞细胞液中产生的NADH必须进入线粒体才能经呼吸链氧化并生成ATP. 磷酸甘油穿梭 苹果酸-天冬氨酸穿梭,五、线粒体穿梭系统,1、磷酸甘油穿梭（P/O=2或1.5）,NAD+,NADH+H+,P-甘油,P-二羟 丙酮,P-甘油,P-二羟丙酮,3-P甘油脱氢酶 （胞液）,FAD,FADH2,3-P甘油脱氢酶 （内膜）,CoQ,Fe-S,FP1,cytb,胞液,外膜,膜间空间,内膜,昆虫飞行肌细胞溶胶NADH利用此穿梭,2、苹果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=3或2.5）,苹果酸,草酰乙酸,NAD+,NADH+H+,苹果酸,草酰乙酸,NAD+,NADH+H+,天冬氨酸,谷氨酸,-酮戊二酸,天冬氨酸,谷氨酸,-酮戊二酸,1,2,4,3,胞液,膜间空间,外膜,内膜,基质,1、胞液的苹果酸脱氢酶 2、线粒体基质的苹果酸脱氢酶 3、胞液的天冬氨酸转氨酶 4、线粒体基质的天冬氨酸转氨酶 、苹果酸-酮戊二酸反向交换载体 天冬氨酸-谷氨酸反向交换载体,1,动物心脏及肝脏 胞质