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1、第二十六章 基因表达及功能分析的 基本策略 STRATEGIES FOR ANALYZING GENE EXPRESSION AND FUNCTION,第一节 基因表达的分析策略 Strategies for Analyzing Gene Expression,一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征,根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为: 封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。 开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等
2、，可以发现和分析未知的基因。 这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。,（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平,1Northern印迹（Northern blot） 既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列 是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术,Northern印迹分析原理示意图,2核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA） 可用于mRNA定量和RNA剪接分析 是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。,核糖核酸酶保护实验原理示意图,可对mRNA
3、进行区域定位 是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。 通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。,3原位杂交（in situ hybridization，ISH）,（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法,1反转录PCR 可用于mRNA的半定量分析 反
4、转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。 该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。,常用于mRNA的定量分析 实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方
5、法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。,2实时定量PCR,目前有5种技术用于实时定量PCR： 其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加； 其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括5核酸酶法（即人们熟知的TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法，它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高。,SYBR Green实时定量PCR分析原理示意图,二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平
6、的表达特征,Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。,（一）采用特异抗体经Western印迹可直接 测定基因编码多肽,蛋白质样品的制备 SDS-PAGE分离 蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 最后经与酶的
7、底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息,Western blot基本程序,酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。 该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。,（二）酶联免疫吸附分析与Western印迹原理 相似但形式不同,特点： 具有特异性； 灵敏度很高； 稳
8、定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原； 既可以做定性试验也可以做定量分析。 被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和免疫学等领域。,酶联免疫吸附分析,免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。,（三）免疫组化实验可对组织/细胞 表达的蛋白质进行原位检测,（immunofluore
9、scence），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。 其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。 免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。,流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析
10、特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。,（四）流式细胞术用于分析 表达特异蛋白质的阳性细胞,流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。 广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。 此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。,三、高通量检测技术成为基因表达研究的有力工具,高通量筛选(High th
11、roughput screening，HTS)技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程。 因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故称“高通量”。 高通量检测技术适合“组学”（omics）研究，更适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。,基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成在同一基片上，组成密集分子排
12、列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。 其中基因表达谱（expression prifile）分析是目前基因芯片应用最多的一个方面，主要采用cDNA芯片，基因表达谱芯片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进行比较，揭示转录组（transcriptome）差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。,（一）基因芯片和高通量测序技术可在基因水平高通量地分析基因表达,2. 高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法,高通量测序技术可以一次对几十万到几百万个DNA分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌, 又被称为深度测序(de
13、ep sequencing)。,在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性； 在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。,1）目前，高通量测序技术不仅仅在DNA测序中起到重要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面：,2）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易地解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。,基因芯片的缺点: 在于它是一个“封闭系统”
14、, 它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变异)。 高通量测序的优势: 在于它是一个“开放系统”, 它的发现能力和寻找新信息的能力从本质上高于芯片技术。,（二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平高通量地分析基因表达,蛋白质芯片（protein chip）是一种对蛋白质的表达和功能进行高通量分析的技术。 是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。,1蛋白质芯片有多种形式和用途,蛋白质检测
15、芯片包括: 抗体芯片 抗原芯片 配体芯片 碳水化合物芯片等,根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为 1. 蛋白质检测芯片 2. 蛋白质功能芯片两大类,目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术又称二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D电泳）。 原理: 根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析
16、，对差异表达的蛋白质进行鉴定。 可同时分离数成百上千的蛋白质。,2双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定,第二节 生物信息学在预测基因 功能中的应用 Bioinformatics Application in Predicting Gene Function,一、利用生物信息学方法进行基因功能注释,(一）通过序列比对预测基因功能,序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具BLAST是进行序列比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的项。BLAST是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许多有特定用途的程序。,BLAST序列数据库搜索程序家族,（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据,最常用的方法有： 差异表达分析（又称基因表达差异分析） 聚类分析 差异表达分析的目的：
