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1、第16章 基因诊断,王慧莲,概述,几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后 基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。,基因诊断经历了三个基本发展阶段,第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为基础，通过限制性片段长度多态性性（RFLP)分析进行 第二阶段：应用PCR技术 第三阶段：应用基因芯片技术,第一节 基因诊断的基础技术,一 .基因诊断中常用的几种技
2、术 （一） 核酸杂交 （二） PCR （三） DNA序列测定 （四） DNA芯片技术,(一)核酸分子杂交技术,(1)方法: 以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析. (2)几种不同形式的核酸分子杂交 a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行
3、定性和定量分析 c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低,原位杂交（in situ hybridization): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类: 玻片原位杂交:如中期的染色体和组 织切片. 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼 龙膜(如硝酸纤维膜),原位杂交的镜像图,(二)PCR技术在基因诊断中的应用,（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnuc
4、leotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO 该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不 存在这种突变； 只与突变探针杂交-突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发 现的类型,（）单链构象多态性（single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析,是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方 法DNA变性
5、形成单链，在中性条件下长度相同的单 链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的 构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE中电泳中表现出不同的迁移率. SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,(3)限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP）分析,基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消
6、失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.,限制性片段长度多态性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms),1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带
7、优点：可靠，检出单碱基突变率可达 缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突 变,（）用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR)进行分析,在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进行甲基化特异性PCR 设计一对甲基化特异性引物（引物中G结合模板中C);和非甲基化特异性引物（引物中A结合模板中U),通过PCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的DNA序列和非甲基化等位基因序列 用于一些疾病和肿瘤的基
8、因诊断,(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析,定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR): 就是对靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分子数N=No(1+E),其中E是指每次循环中参与复制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求出No. 但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较多.,n,a. 通过测定PCR产物量 方法: 对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还可对未知量的靶DNA进行绝对定量. b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析: 方法:将待测D
9、NA标本进行倍数稀释,直至扩增不到靶基因的稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数的相对量,是一种半定量方法.,c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析 方法:该方法是在一个试管内同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA的用量、可扩增性和管间扩增效率的变化,通过比较两段序列PCR扩增产物电泳带的荧光强度,对靶序列进行定量分析 d. 采用竞争抑制法对靶核酸进行定量分析: 方法:参照标准不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,与待测序列具有相同的引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子. 方法:将竞争模板作系列稀释后加入恒量的样品DNA进行PCR
10、扩增,通过分离和分析竞争模板和样品DNA的PCR产量,对样品DNA进行定量分析,e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术 是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点. FQ-PCR技术的两种定量形式: 绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量. 如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确. .相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin, rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比
11、较,反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素.,(三）DNA序列测序,1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。 自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。 DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质,（四）DNA芯片技术,DNA芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray) 该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核
12、酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。 基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。 该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。,第二节 对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略,一.通过致病基因的检测诊断疾病 已经基本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制，相关的基因已被克隆
13、，测序，并被定位在染色体上。 如：一些与疾病有关的内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。 诊断方法：根据突变的基因序列设计探针.,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病,许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。 原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。,三.通过与疾病相关的克隆建立疾病基因诊断指标,40-60年代: 功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能
14、相关的线索确定与疾病相关的基因: 如苯丙酮尿症与镰刀型的贫血病等. 70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色体-基因的反向遗传学策略对没有明显的表型或生化功能异常的疾病. 90- 今 :表型克隆,不考虑基因在染色体上的位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异.,利用表型克隆诊断疾病,表型克隆：对疾病相关的一组基因进行克隆 一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。不可能通过前面的方法来诊断，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间的差异序列，鉴定与疾病相关
15、的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。 方法：根据克隆到的一组基因制作相应的一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关的基因来诊断多基因病,第三节 遗传病的基因诊断,一. 遗传病基因诊断的策略 1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆. 2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.,人类基因组上的DNA遗传标记,限制性片段长度多态性(RFLPs ) 1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites ) 1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide p
16、olymor-phisms SNPs),短串联重复序列 STRs (short tendem repeats, Microsatellites ),STR广泛存在于人基因组，占约5%， 基本单位是1bp-8bp的串联重复， 重复次数 n=15-60，已知8000多个， 主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。 1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。,定义:主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记. 人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。 1996年，Lan
