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1、1,食品微生物学检验技术,刘晓庆,2,微生物试验方法,取样 培养基制备 灭菌和消毒 无菌操作 培养、计数,饮料微生物检测方法 国标：菌落总数、霉菌和酵母菌、大肠菌群、致病菌 企标要求 常见问题处理,3,取样,准备工作 取样工具：消毒，灭菌 样品存放容器：清洁、干燥 取样标签 取样注意问题 采样均匀 避免污染 标记准确、牢固 及时保存 若不及时检测应保存在4冰箱，最长不超过24h。,4,培养基制备,玻璃器皿的清洗 新购的玻璃器皿 将器皿放入盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。 常用旧玻璃器皿的洗涤 确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗涤剂进行刷洗；
2、带菌玻璃器皿的洗涤 凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗。,5,培养基制备,为满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含 碳源、氮源、水、无机盐、能源和生长因子六大类营养 物质。 购买：选择质量好的培养基，注意保质期，记录收 货期。 贮存：30以下，避光保存于阴凉干燥处，使用 后，拧紧瓶盖，避免吸潮、氧化或污染。 保质期：一般未开封的培养基可保质年，已开封 的可保质半年。建议在瓶体注明开封日期。对于个别极 易变质的品种，建议冷藏保存，可延长保质期。,6,培养基制备,培养基分类 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： 天然培养基 是利用各
3、种动、植物或微生物的原料，成分难以确切知道。主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 合成培养基 是用已知化学成分的化学药品配制而成。化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,7,培养基制备,培养基分类 根据培养基的物理状态来区分： 液体培养基
4、 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2-1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,8,培养基分类 根据培养基的用途来区分： 选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长
5、；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。 增殖培养基：常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。,培养基制备,9,培养基分类 根据培养基的用途来区分： 鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基。 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道
6、菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。,培养基制备,10,培养基制备,影响因素 洗涤剂中含有表面活性剂，会影响微生物生长，注意冲洗干净。 一般不采用自来水配制培养基，因为自来水相对杂质较多，有些含有较多的Ca2+、Mg2+离子，可与蛋白胨、肉浸汁中的磷酸盐生成磷酸钙、磷酸镁，一旦高压灭菌后，就会析出沉淀，从而影响到培养基的透明度，不利于微生物的培养与观察。 蒸馏水或纯净水中所含的杂质较少，所制成的培养基透明度高，有利于观察。,11,培养基制备,制备： 准确称取各组分，一次完成，不要中断； 混合后，煮沸或者热水溶化，充分溶解； 分装，装量2/3容积 灭菌，高压灭菌的
7、温度与时间随培养基的种类不同而有所差别。含糖类物质培养基（如乳糖胆盐发酵培养基）则灭菌温度不能过高，以免糖类物质被破坏，影响培养微生物的观察效果。 灭菌后用不完的培养基4以下存放 含琼脂培养基：控制水浴温度，水浴时间不宜超过4h；若在4h内不能及时使用，应迅速冷却，使其凝固，使用前再进行复溶。但不可多次复溶，否则会影响培养基的pH值，并导致凝胶强度下降。 加水时避免干粉挂壁粘底，加热时避免烧糊。 除个别特殊品种含有不溶成分外，应澄清，无絮状物，无沉淀。,12,培养基制备,注意事项 培养基所用化学药品均应是化学纯。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长; 因培
8、养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。 培养基的分装，应选择适当容器:液体分装至试管1/4左右为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基，则分装至试管的1/2-1/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的2/3为宜；9cm的培养皿一般可倒入15ml培养基。 一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌20分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类、明胶培养基应采用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入经冷却约50C左右
9、的培养基中。 含糖培养基：115灭菌10min或113灭菌15min 无糖培养基：121灭菌20min,13,灭菌和消毒,紫外线照射：用于空气、物体表面消毒。紫外线的波长范围是136400nm，波长200300nm的紫外线对微生物有致死效应。紫外线最强杀菌作用的波长为265266nm，这是核酸的最大吸收波长。实验室用的紫外线杀菌灯的波长为253.7nm。 注意：穿透能力极差，不能穿透一张厚纸。故不能用于液体饮料的消毒。 75%酒精：乙醇的杀菌力受浓度影响，并不是浓度越高杀菌力越好，75%的乙醇杀菌力最强，超过此浓度至无水乙醇的效果差，因为高浓度时可使菌体迅速脱水，表面蛋白凝固，形成了保护膜，阻
10、止了乙醇分子进入菌体，会影响杀菌作用。,14,灭菌和消毒,温度 ：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。 灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品等的灭菌。 干热空气灭菌法：实验室常用方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160-170，恒温1-2h即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。,15,灭菌和消毒,湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内
11、蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。 煮沸消毒法：10023h,芽孢死亡。1001020min，营养体死亡。在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。 间歇灭菌法：常压蒸汽灭菌，1003060min，连续3次，间隔培养（2837）24h。适合于不宜高压蒸汽灭菌的物品，可杀灭芽孢。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。 高压蒸汽灭菌：利用压力的增加，达到温度升高的目的。12120min，效果最好。用于液体培养基，无菌水等灭菌。体积大，传热性差的物品，灭菌时间应适当延长。适用
12、于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。,16,灭菌和消毒,要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。 培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。 吸管：每根独立包好后，再放进去高压锅灭菌；如果是放在不锈钢的筒子里面的话，可以不用独立包，但是取的时候一定要注意不要污染其他的移液管； 试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/
13、3塞进管口。 玻璃器皿：包好后摆入电热烘箱进行干灭时，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。灭好后待烘箱内温度自然降温到60以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。,17,灭菌和消毒,高压蒸汽灭菌操作流程 关好排水阀门，放入纯净水或蒸馏水至标度。注意水量一定要加足，否则容易造成事故。 将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。同时旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。 通电加温，打开排气活门，排尽锅内的空气。通常当压力表指针升至5磅或0.05MPa时，打开排气活门放气，待压力表指针降至零点一小段时间后，再关闭活门。即活门冲
14、出的全部是蒸汽时则表示彻底。恒温灭菌: 0.1MPa 或15磅压力保持2030分钟。 降温：自然降温或打开活门排汽降温。注意勿使排气过快，一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。 当锅内蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，要立即打开锅盖。 取出灭菌物品：当锅内温度下降到60左右时取器材或培养基。 长时间不用时，应将高压灭菌器内的剩余水排出。 验证灭菌效果。把灭菌培养基放入25温箱中，培养48小时观察灭菌效果。 48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。,18,高压蒸汽灭菌注意事项,灭菌时要排净高压锅中的空气。空气不排净，压力达到预定值时，温度仍为100。 为了避免培养基营养
15、成分受到破坏，在灭菌的过程中应严格把握灭菌的温度与时间，不能随意地提高灭菌的温度或延长灭菌时间。 由于高压灭菌会导致培养基的体积和浓度有所变化，在配制培养基时，每100mL培养基可适量增加5mL左右的蒸馏水。 预防培养基在加热溶解、灭菌煮沸等过程中导致水分挥发、损失而使培养基的浓度过大或体积减少。,19,无菌操作,GLP（良好实验室规范） 工作区域 缓冲间不是储藏室；无菌操作室、超净台禁止存放堆积杂物； 缓冲间和无菌室的门错开开启，减少外界空气侵入； 紫外灯消毒台面、地面，不能同时开启鼓风； 门窗关闭，避免扬尘； 用75%乙醇消毒台面； 使用霉菌的操作台最好是专用，防止污染的操作。 超净工作台
16、要满足的条件：每周一次做空气沉降菌实验，应满足细菌2个/平皿/30min，霉菌、酵母菌：0个/平皿/30min。,20,无菌操作,人员 进入无菌室换专用的实验服、帽、鞋，戴好口罩 热水皂液洗手；75%乙醇消毒手和手臂 操作 靠近火焰上半球操作 所有器具接触培养物的部分必须无菌 注意避免微生物污染,21,培 养,倒置培养 适当的温度 细菌：36 霉菌、酵母：28 大肠菌群：36 注意：培养箱的温度校正 保持一定的湿度 培养箱中置一杯水 定时查看，并做记录,22,计 数,计数场所洁净，明亮 保持培养皿的底部清洁 可借助放大镜观察 有霉菌生长的平皿不可打开皿盖 每块平皿上最佳数量为30300 若无菌生长，则记录为300，则可估读数,23,饮料微生物检测方法,膜过滤法 标准平板计数法 棉拭法 显微直接计数法 食品卫生微生物检验国标 嗜酸耐热菌检测 致病菌检测 企标要求,24,膜过滤法,使用范围： 可以过滤的样品 样品含菌量相对较少，一般300cfu/ml 优点：可富集微生物，更灵敏。 过滤设备消毒灭菌：121，15min 一次性无菌滤膜（直径47mm） 0.45m：细菌总数和大
