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1、第十六章 基因工程和蛋白质工程简介,第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介,返回,第一节 DNA重组和基因工程,基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,一、DNA重组的技术路线 二、基因工程的应用与前景 三、DNA体外重组常用的酶,返回,DNA重组的 技术路线,1、目的基因的制备2、载体的构建3、
2、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定,Ti质粒结构,植物冠瘿瘤,pBR322质粒的结构,以噬菌体为载体进行DNA克隆,DNA,用限制性内切酶除去中间一段,与外源DNA连接,重组载体的体外包装,带有外源DNA的噬菌体,太小不能被包装,噬菌体感染大肠杆菌的途径,DNA重组体的筛选, 载体特征的直接筛选 菌落的原位杂交 免疫学方法,pBR322质粒结构,如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活,如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活,原位杂交法筛选DNA重组体图解,复印至硝酸纤维素膜上,用NaOH菌体裂解DNA变性,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cD
3、NA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,Southern和Western印迹法,DNA frangment,Electrophoresis,Transfer of DNA by blotting,32P-labled DNA probe,Autoradiography,Agarrose gel,Autoradiogram,Nitrocellulose sheet,Autor
4、adiogram,Polymer sheet,SDS-Polyacrylamide gel,Transfer protein,Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody,Protein band detected by specific antibody,Autoradiography,DNA重组技术的应用,(1) 开辟生物学研究的新纪元 反向生物学（invese biology）的诞生 （2）促进生物技术产业的兴起 基因药物 基因诊断和治疗 转基因动植物,胰岛素原的人工合成,胰脏,(A)n 胰岛素原mRN
5、A,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原基因,与质粒连接,感染E.coli,胰岛素原,Ti质粒为载体的植物基因工程,I 二元载体系统,II 共整合载体,III T-DNA的转移与整合,Ti辅助质粒,Ti辅助DNA给体质粒,Ti辅助DNA给体质粒,pBR型质粒（给体质粒）,宿主特异性,外源基因,宿主特异性,整合,带有外源基因的Ti质粒,植物DNA,Ti质粒转移并插入植物DNA,第二节 蛋白质工程简介,蛋白质技术和核酸技术的相互增强,在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国
6、基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。 研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。,生物酶工程示意图,酶的蛋白质结构功能,新酶分子蓝图,选择性修饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,
7、效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA重组技术,DNA重组技术,蛋白质技术和核酸技术的相互增强,插入表达载体,转化寄主细胞,推导出AA顺序,制备合成肽,制备对所编码蛋白专一的抗体,基因或cDNA,蛋白质,蛋白质,测定出AA顺序,合成cDNA探针,制备专一的抗体,沉淀核糖体分离mRNA,用Southern印迹法筛选DNA文库,基因或cDNA,第三节 核酸研究技术简介,一、DNA序列测定 二、基因文库与cDNA文库 三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,DNA测序的基本战略,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终
8、点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。 酶法 化学法 测序技术进展,酶法序列分析的原理,酶反应,电泳方向,GG,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCGTTG,GGCCATCG,GG
9、CCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,A C G T,读出模板互补序列,读出模板序列,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGT,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCA,GGCCAT,GGCC,GGC,DNA的Sanger测序法(酶法),读出模板互补序列,dNTP,凝胶电泳,反应混合物,Klenow酶,未知序列的单链DNA,读出待测序列,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,A C T G,DNA的测序仪示意图,computer analysis,凝胶中DNA移动方向,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高
10、灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,DNA的化学测序示意图,反应试剂 G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸 T+C反应：肼 C反应：NaCl+肼,测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记 毛细管电泳,单色荧光标记 平板电泳,同位素标记 平板电泳,A,C,G,T,测序图谱,T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T,引物标记法测序(Dye Primer),一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。,反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样,终止法测序(Dye Terminator),一个样本，1个反应。反应中包含分别带
11、4色荧光标记的ddNTP(终止子),+,测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。,三基因文库与cDNA文库,1基因文库（genomic library） cDNA文库（complemental DNA library） 2 . 文库的构建,基因文库,基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic library。,基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于
12、该文库中？其计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%； f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。,cDNA文库,真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，
13、对基因表达和有关mRNA都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先转录成cDNA，再建立文库。,为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-1/n) N cDNA文库所包含克隆的数目； p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%； 1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。,基因文库和cDNA文库的建立,组织,可克隆之DNA,载体,DNA,cDNA,mRNA,部分或完全酶解DNA,
14、DNA长度分级,甲基化，双链接头DNA,DNA与载体连接,引入大肠杆菌,鉴定文库的滴度和特性,扩增后供长期储存,筛选出所需要的克隆,噬菌体为载体的基因文库的构建,四、聚合酶链式反应（PCR）,1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X-扩增效率; n一循环次数。,（2）
15、 PCR的应用,（1）PCR的原理,PCR技术原理示意图,靶序列,变性和引物复姓,循环1,循环2,循环3,变性和引物复姓,链延伸,Tag酶,链延伸,PCR技术的发展与应用,用于合成特异探针； 用于DNA的测序； 将逆转录与PCR相偶联 （RT-PCR）； 用于基因定位诱变； 末知序列的PCR扩增； 基因组序列的比较研究； 用于临床诊断。,DNA芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。 芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技术的发展。,DNA芯片技
