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1、第9章 酶促反应动力学,一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速率的影响 三、酶的抑制作用 四、温度对酶反应的影响 五、pH对酶反应的影响 六、激活剂对酶反应的影响,(kinetics of enzyme-catalyzed reaction),研究酶促反应动力学的意义,酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。,二、底物浓度对酶反应速率的影响,中间复合物学说,为了解释这个现象
2、，Henri和Wurtz提出了酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式表示： S + E ES P + E,酶底物中间复合物存在的证据,电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复合物。 酶与底物结合后光谱发生变化。 溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。 分离到了酶底物复合物。 超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。 平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同(半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧)。,（1）平衡学说,（Henri，Michaelis和Menten方程）,1902年H
3、enri和Brown提出了酶催化的反应机理 1913年Michaelis和Menten完善了这个理论，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。,平衡学说推导反应速度方程的假设前提,在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以E和ES两种状态存在。,根据平衡学说推导速度方程,设Vf 为E与S结合的速度，Vr 为ES解离的速度，则Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡时VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES 又 S ES SESS,根据平衡学说推导速度方程,k1 ( E0ES )
4、 S k 2 ES 解出 ES 得,令 ， 则,根据平衡学说推导速度方程,由于V = k 3 ES，代入前式 得 因为当所有的E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm = k 3 E0 ，所以 这就是米氏方程。,米氏方程,米氏方程是一个双曲线方程，若以S为自变量，V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。,（2）稳态理论,1925年，Briggs和Haldane提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正： 在 反应式中，k3值不小，后一步骤不是限速步骤。 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于
5、稳态水平，此时ES的解离和分解速率之和等于ES的形成速率，,根据稳态学说推导速度方程,产生ES的速率 消耗ES的速率 稳态时 所以,根据稳态学说推导速度方程,移项得,令 ，代入上式得,将上式中的ES解出得,此ES即为稳态时的复合物浓度。,根据稳态学说推导速度方程,因为酶反应速率与ES成正比，即 所以,又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即 ，代入上式得,（稳态法）,（快速平衡法）,两个米氏方程的区别,这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是Ks，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是Km。,Ks是ES的解离平衡常数,米氏方程的几个特点,从米氏方程中可以看出：
6、当S Km时， ，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应； 当S = Km时， ，所以，Km的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。,米氏方程曲线,米氏常数的意义, Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，Km是定值。 Km可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中Km最小的底物是天然底物。 当k3 k2时，Km = Ks，可以作为判断酶与底物亲和力的指标，Km越小，酶与底物的亲和力越大。 根据Km值，可以计算出在某一底物浓度下，反应速率是最大反应速率的百分之多少。 根据细胞内酶反应正反两方面的底物浓度，以及两方面的Km值，可以
7、推测细胞内代谢的方向。,米氏方程S与 V / Vm 的关系,当S=10Km时，V=0.91Vm 当S=0.1Km时，V=0.091Vm 反之，可以计算出要达到一定的最大反应速率的分数，需要加多少底物。 （见P360表9-2）,Vm和k3的意义,在一定的反应条件下，Vm与酶浓度成正比。当SKm时，V = Vm = k3E0，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，k3是一级反应速率常数，k3表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），这时的k3又可以写成 kcat，kcat 越大，说明酶的催化效率越高。,kcat /Km的意义,Kcat /Km表示酶的催化效率，K
8、cat /Km越大，催化效率越高。 ，其最大值极限是k1，而k1是酶与底物结合的速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度的影响。,作图法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk双倒数作图法）,将米氏方程两边取倒数得 在一系列S下测出相应的反应速率v，以 对 作图，可得出Km和Vm值。,米氏方程的双倒数图,多底物的酶促反应动力学,（酶促反应按底物分子数的分类）,多底物反应按动力学机制分类（序列反应）,底物的结合和产物的释放有一定的顺序： E+A+BEABEPQE+P+Q 产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又可以分为两种类型。,有序反应（ordered reaction）,其中P是
9、B转变的产物，Q是A转变的产物。 如脱氢酶的辅酶NAD(P)+相当于A，NAD(P)H相当于Q。,随机反应（random reaction）,如肌酸激酶催化肌酸与ATP反应生成磷酸肌酸和ADP。,乒乓反应（ping pong reaction）,如转氨酶催化转氨反应： 氨基酸1 酮酸2 酮酸1 氨基酸2,A B P Q,三、酶的抑制作用,因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。 研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基
10、本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。,抑制程度的表示方法,（1）相对活力分数（残余活力分数） （2）相对活力百分数（残余活力百分数） （3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数） （4）抑制百分数,抑制作用的类型,1不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。 2可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。,可逆抑制作用的3种类型,（1）竞争性抑制（competi
11、tive inhibition） I 和 S 竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。,竞争性抑制剂举例,可逆抑制作用的3种类型,（2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） I 与 S 可以分别与酶结合，谁先结合都可以，形成 ESI 三元复合物，但 ESI 中的 S 不能转变成产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。,竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理,可逆抑制作用的3种类型,（3）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition） I 只与 ES 结合，只有 ES 能
12、分解出产物，ESI 中的 S 不能转变成产物。由于 I 的存在促进了 E 和S 的结合，所以称为反竞争性抑制。 ES + I ESI P + E + I,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别, 在反应系统中加入一定量的抑制剂，以及不同量的酶，测定反应速率与酶量的关系。斜率较小的直线是可逆抑制剂，不通过原点但斜率与对照相同的是不可逆抑制剂。,1. control 2. irreversible inhibitor 3. reversible inhibitor,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别, 在反应系统中加入不同量的酶及抑制剂，作不同抑制剂浓度下反应速率对酶量的直线。可逆抑制剂得
13、到的是一组通过原点但斜率不同的直线，不可逆抑制剂得到的是一组不通过原点但斜率与对照相同的平行线。,一些重要的不可逆抑制剂,（1）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物 重金属盐 烷化试剂 氰化物、硫化物和CO 青霉素 （2）专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂,有机磷化合物,很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化
14、醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来，使酶恢复活力，达到解毒的作用。,有机磷化合物,解磷定的解毒机理,有机汞化合物,有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。,有机砷化合物,有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。,路易斯毒气,为了六十一个阶级兄弟,重金属盐,Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。 烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。,烷化试剂,氰化物、硫化
15、物和CO,氰化物能与细胞色素氧化酶中的Fe2+结合，使酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶形成较为稳定的络合物，使酶失活。 糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。,青霉素,青霉素的抗菌机理,Ks型不可逆抑制剂,此类抑制剂结构与底物类似，并带有高反应性基团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。,胰蛋白酶的人工底物 胰蛋白酶的Ks型抑制剂,Kcat型不可逆抑制剂,此类抑制剂不但结构与底物类似，而且需要经酶催化反应后才产生高反应性基团，比Ks型不可逆抑制
16、剂专一性更强。,-卤代-D-丙氨酸 磷酸吡哆醛,丙氨酸消旋酶,可逆抑制剂（底物的类似物）,合成叶酸的组分,磺胺药物竞争抑制二氢叶酸合成酶的活性,蝶呤 对氨基苯甲酸 谷氨酸 叶酸,（磺胺药物）,可逆抑制剂 （过渡态底物类似物）,过渡态底物类似物抑制力更强，因为酶对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强得多。,多种酶催化反应时的过渡态底物,过渡态底物类似物,可逆抑制剂 （过渡态底物类似物）,可逆抑制剂 （过渡态底物类似物）,四、温度对酶反应的影响,在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞内酶的最适反应温度在3540，植物细胞中的酶可达4050，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生
