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1、第三章 基因工程载体,生物科学与技术学院,基因工程载体的概念,把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。,复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。 选择标记基因区：可以筛选重组体。 多克隆位点：方便外源基因的插入。,第一节 质粒载体,质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,质粒,染色体,质粒的一般生物学特
2、性： 分子大小差异大：1200 kb 编码基因少：23个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。 形状：双链环状DNA；线性双链DNA；超螺旋等。,质粒的空间构型： 质粒空间构型与电泳速率： 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。,共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（super coil） 开环DNA（open circular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口 线形DNA（linear，lDNA）,质粒的类型： 在大肠杆
3、菌中的质粒，可以分为： 1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。 2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合基因工程的安全要求。,大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免
4、疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。,质粒的复制类型 严紧型质粒（stringent plasmid）：拷贝数少，只有13份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 松弛型质粒（relaxed plasmid）：拷贝数多，有1060份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。 质粒的不相容性 又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。,质粒的复制过程
5、质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以型复制为主。在型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。,Ori复制起点,型复制,滚环复制,在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。,复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到
6、一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。,质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。,质粒载体的构建 天然质粒的局限性 1、分子量大，拷贝数
7、低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。EColR I 酶切位点位于Tetr 基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。 2、天然质粒ColE1质粒，长度为6.3 kb，唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素E1（colicin E1）内部。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞。 质粒载体的发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如
8、pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,理想质粒载体必须具备的基本条件： 1、具有复制起点（ORI） 2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。,质粒的选择标记及其工作原理： 抗菌素抗
9、性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记. 氨苄青霉素抗性（Ampr）:青霉素的衍生物。氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。 卡那霉素抗性（Kanr） :卡那霉素通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，从而杀死细菌。Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。 四环素抗性（Tetr）:四环素通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。 链霉素
10、抗性（Strr） :链霉素通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译，从而杀死细菌。Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。 氯霉素抗性（Cmlr）:氯霉素通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,人工构建的质粒载体的类型 高拷贝数的质粒载体 pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数10003000个。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物
11、。 低拷贝数的质粒载体 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低，不适合大量扩增DNA用。但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。如pLG338、pLG339、pHSG415等。 失控的质粒载体 温度敏感型复制控制质粒，温度低于37度，拷贝数很少； 温度增加，大于40度时，拷贝数会很快增加到1000个以上。B. E. Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、pBEU2等。,插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。 正选择的质粒载体 直接选择转化后
12、的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。如pUR2、pTR262等。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。 克隆质粒载体 专用于基因和DNA片段无性繁殖的质粒载体。纯粹的获取基因和DNA片段。,常用的质粒载体,pBR322,1、元件来源 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC
13、101的Tetr 基因。 2、长度 4363bp 3、选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性 4、克隆位点 24个克隆位点，其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,BamHI片段(Tcr),pBR322,PstI(Apr)片段,重组分子 (Aps Tcr),PstI片段,外源DNA,BamHI片段,重组分子I (Apr Tcs）,分别转化E.coli (ApS TcS),重组分子 (Aps Tcr),影印到Tc平板上,Apr Tcr为原载体 即为非重组子,影印到A
14、p平板上,重组分子I (Apr Tcs）,涂布Ap平板,Apr转化子,涂布Tc平板,Tcr转化子,Apr TcS为重组子,ApS Tcr为重组子,影印,pBR322的优点,双抗菌素抗性选择标记 没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy。 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。,pBR322的缺点,保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被pColK质粒编码的m
15、ob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！,pBR322的改良,删除mob识别位点 如pAT153，pBR322的改造衍生质粒，除去了mob识别位点，同时增加质粒的拷贝数。 改造EcoR I 位点 如pBR325，使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。,cmlr,常用的质粒载体,pUC系列,University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。如pUC7、pUC
16、8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。,1、元件来源 复制起点ori-pBR322的 ori Ampr 基因-pBR322的Ampr基因 大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ基因） 多克隆位点（MCS）区段-位于lacZ基因中的靠近5-端。 2、长度 约2.7kb,3、克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。 4、选择标记 PUC系列质粒载体的选择标记是Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。,乳糖操纵子调节机制,乳糖操纵子(lac operon)的结构,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶和Xgal的显色反应,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），也叫-肽（ lacZ ） 。,Xgal是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物； -半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,
