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1、第4章 固定化酶和固定化细胞,主要内容： 4.4 固定化活细胞 4.5 酶催化反应器及其类型,4.4 固定化活细胞,利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞破碎，才能将里面的酶提取出来，这就增加了工序和成本，且提取的酶往往不够稳定。因此人们设想直接固定那些含有所需胞内酶的细胞，并且就用这样的细胞来催化化学反应。20世纪70年代，在固定化酶的基础上科学家们研制成固定化细胞（Immobilized Cell），并且用于生产。70年代末，法国研究成功固定化细胞生产啤酒，80年代初我国居乃琥等用固定化细胞批量生产啤酒和酒精取得重要研究成果。,固定化细胞按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。最初固
2、定化的细胞是死细胞或静止态细胞，只利用其酶活性，近年来发展到固定化活细胞。前者经固定化后，虽然整个细胞活力消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活力；而后者经固定化后，细胞仍保存活性，能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。 例如，琼脂包埋的酵母细胞数初时为106个/m3，在营养培养基里培养两天后，细胞数可达1091010个/m3。,与酶的固定化相比，固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，有效地利用游离细胞完整的酶系统和细胞膜的选择通透性，既具有固定化酶的优点，又具有其自身的优越性：,无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本； 可
3、进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易；,固定化细胞的优越性,对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； 细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围比固定化酶更为广泛。,固定化细胞的优越性,当然，固定化细胞也有其自身的缺点，如：必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细
4、胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。 固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，其制备方法也基本相同。固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。,4.5 酶催化反应器及其类型,以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶反应器。,4.5.1酶反应器的类型,酶反应器有两种类型： 一类是直接用游离酶进行反应，即均相酶反应器； 另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器。 均相酶反应能在批量式搅拌桶反应器或超滤膜反应器中进行，而非均相酶反应则可在多种反应器中进行，适用于连续催化反应，包括：连续流搅拌桶反应器、填充床反应器、流化床反应器、连续搅拌桶-超
5、滤和循环式反应器等。,4.5.2反应器的结构特点,这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料等食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。但是，常用于游离酶。,图4-2 批量式搅拌桶反应器,4.5.2.1 批量式搅拌桶反应器,这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡，如图4-3。,4.5.2.2 连续流搅拌桶反应器 (Continuous F
6、low Stirred Tand Reactor，缩写CSTR),图4-3 连续流搅拌桶反应器,在理想的连续流搅拌桶反应器中，反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。CSTR的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有较高的转化率。,其缺点是，由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。近来对此类型反应器进行了改良，就是将载有酶的圆片聚合物固定在搅拌轴上或者放置在与搅拌轴一起转动的金属网筐内，这样，既能保证反应液搅拌均匀，同时又不致损坏固定化酶。,4.5.2.3 填充床反应器(Packed
7、 Bed Reactor，缩写PBR),图4-4填充床反应器,填充床反应器又称固定床反应器（如图4-4）。可填充多向异性半透性中空纤维制成管状，内部填充酶膜、酶片等。在填充床反应器内，底物在一定方向上以恒定的速度通过固定化酶柱。若柱的横截面上每一点液体流动的速度完全相同，则可以认为反应器是在理想条件下作为活塞式流动反应器（Plug Flow Reactor，PFR）运转。由于流动方向上存在速度和温度梯度，在轴方向上存在底物的扩散，所以实际上总是不可能完全符合理想化的条件。,4.5.2.4 流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，缩写为FBR),图4-5 流化床反应器,流化床型反
8、应器是种装有较小颗粒的垂直塔式反应器。反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其结构如图4-5。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好。,4.5.2.5 连续搅拌桶-超滤反应器(CSTRUF),图4-6 连续搅拌桶-超滤反应器,CSTRUF结构是CSTR与超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。其结构如图5-6。该超滤器中的半透性超滤膜只允许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。因此，可以将小分子产
9、物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,对这类反应器在技术上的可行性已得到了证实，例如进行纤维素的连续糖化、用-淀粉酶水解淀粉、用转化酶水解蔗糖和用青霉素酶把青霉素G转化成6-氨基青霉烷酸（6-APA）等生化过程。此外，还用于小分子产物（葡萄糖、麦芽糖）与大分子底物（淀粉、纤维素）的分离。,4.5.2.6 循环反应器（Recycle Reactor，RCR）,外循环反应器,内循环反应器,循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。,4.5.3膜式反应器,膜
10、式反应器是20世纪70年代以来发展起来的一种新型反应器，它是利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的一种反应器。,4.5.3.1 膜式反应器的类型 根据酶的存在状态、相数、膜组件型式、膜材料类型、耦合方式、传质推动力等的不同，酶膜反应器有不同的分类方式。根据膜组件的型式不同，可把酶膜反应器分为板框式、螺旋卷式、管式和中空纤维式酶膜反应器。以下以螺旋卷膜式反应器和中空纤维膜式反应器为例来说明。,（1）螺旋卷膜式反应器 此反应器的螺旋结构是将含酶的膜片与支持材料交替地缠绕在中心棒上。所用的膜片一般是胶原蛋白；而支持材料则是一种称为凡克塞(vexar)的惰性聚合网状物。后者可以将相邻的两层含酶膜片
11、分开来，以防止膜层相互重叠，堵塞流道。把上述螺旋元件装进圆筒，筒两端加盖板，并安装进出口管，这样，就制成了螺旋卷膜式反应器。,含酶的膜是半透性膜，只允许小分子的底物和产物通过膜，而大分子酶则不能通过。该反应器有许多优点，例如，螺旋模型可将流体流动的单元分隔成许多独立空间，当底物溶液流经各个独立空间，并与酶接触时，均有相同的流体力学条件和停留时间，可改善接触效果，消除短路；另外，网状支持材料可以提高每一流动间隔的混合效果，加快物质传递。,（2）中空纤维膜式反应器 这类反应器是把酶结合于半透性的中空纤维上，中空纤维壁的内外结构一般是不同的。其内层是紧密光滑的半透性膜，有一定的分子截留值，可以截留大
12、分子物质如酶，而允许小分子物质通过。其外层是多孔海绵状的支持层。将酶固定于中空纤维的支持层中，然后，将许多含酶的中空纤维集中成束，装进圆筒内，筒两端封闭，并安装进出口管道，这样便制成了中空纤维膜式反应器。,用这种固定化酶填充的反应器可以提供较大的催化表面，其缺点是中空纤维的制造极为困难，难以保证纤维束内流体流动的均匀性，以及存在较大的物质传递阻力等。,4.5.3.2 膜式反应器的特点 与一般反应器相比，酶膜反应器具有以下优点： （1）反应转化率不受化学平衡转化率的限制，这是酶膜反应器最为显著的特点之一。许多重要的化学反应都是平衡反应，使用传统的反应器无法突破平衡转化率的限制。而在膜反应器中，膜
13、的选择透过性可使某些组分(如产物)的连续脱除成为可能，从而可促使化学平衡发生移动，大大提高了反应的转化率。,（2）酶膜反应器可将目的产物分离出去，而酶可以重复利用，可实现连续操作，并有可能提高复杂反应的选择性。 （3）膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似生物膜的环境中高效发挥作用。,（4）可实现对流传质代替自由扩散，强化了传质速率，提高了反应速率。填充床与流化床反应器中，质量传递常会因分子扩散的制约而影响反应的进程，而酶膜反应器可通过对流扩散消除这种影响，从而使传质速率加快，反应速度提高。,（5）可以简化工艺流程和操作步骤，有可能使产物分离、反应物净化及化学反应等几个单元操作在一个膜反应器中进行
14、，从而可以同时起到降低生产成本和增加产量的作用。 （6）膜作为相分离器和相接触器，避免了乳化和破乳等问题，也摆脱了液泛的限制。,但是膜反应器在使用过程中也存在着一些问题，这些问题严重制约了膜反应器的推广应用： 由于膜的加工水平较低，膜孔分布与形态结构的均一性差，造成酶分子和小分子激活剂(金属离子或辅助因子等)的泄漏损失，需要在酶促反应过程中不断添加，既增加成本又造成操作过程的复杂化。,酶在膜表面的随机吸附引起酶空间构型的改变或活性位点的遮蔽，有些膜材料还可使酶中毒失活，从而降低或破坏酶的催化活性。 酶分子在酶膜反应器中容易因湍流等原因而发生剪切失活。,有些情形下，由于产物分子在靠近膜面的位置逐
15、渐积聚而形成凝胶层，造成酶膜反应器中严重的产物抑制降低了生产效率。 浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能力急剧下降，膜孔堵塞、膜厚增加使膜的结构形态发生不利变化，膜需要频繁地清洗或更换。,4.5.3.3 膜式反应器的应用 酶膜反应器把酶促反应与膜的选择性物质传递有效地结合在一起，从而创造出有利的过程热力学和动力学，在生物、医药、化工、环境等领域得到了越来越广泛的应用。目前膜反应器的应用主要有：辅酶或辅助因子的再生、有机相酶催化、手性拆分与手性合成、反胶团中的酶催化、生物大分子的水解等。,其在食品中的应用如：透过果胶水解来降低果汁粘度；通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳清中乳
16、糖的含量；通过多酚化合物和花色素的转化来进行白酒的处理；从牛奶产品中去除过氧化物等。 酶膜反应器与传统反应器相比，具有许多现实意义。随着膜式反应器应用中一些问题的解决，膜式反应器将会得到越来越广泛的应用。,以上各种类型的酶反应器都可供使用，但并不存在一种通用的理想反应器。在酶促反应中，反应器的选择是一个十分重要的问题。在选择反应器时，除应考虑固定化酶的形状及稳定性、底物与产物性质和载体性质外，还需考虑生产成本、操作方式及反应器应用的可塑性等因素。在生产中，必须根据具体情况，针对系统的特点，选择和使用合适的反应器。,第5章 蛋白酶、溶菌酶（2学时）,主要内容： 5.1 蛋白酶 5.2 溶菌酶,5.1蛋白酶,蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白质改性中都大量使用蛋白酶。人体消化道中存在的胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶使人体摄入的蛋白质水解成小分子肽和氨基酸。,5.1.1蛋白质的特异性要求,1、R1和R2基团的性质： 胰凝乳蛋白酶仅能水解R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基的侧链的肽键；胰蛋白酶仅能水解R1是精氨酸或赖氨酸残基的侧
