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1、基因治疗的原理 与研究进展,The Advance and Principle of Gene Therapy,1,基因治疗分类,体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代,2,一、基因治疗的概念,狭义的概念 指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的 广义的概念 指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。,3,二、基因治疗的总体策略,(一)基因矫正 纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。 (二
2、)基因置换 指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。 (三)基因增补 把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去,4,(四)基因失活 将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。 (五)“自杀基因”的应用 在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因” (六)免疫基因治疗 免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与
3、抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。 (七)耐药基因治疗 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1,5,三、基因治疗的基本程序,(一)治疗性基因的获得 (二)基因载体的选择 (三)靶细胞的选择 (四)基因转移方法 (五)转导细胞的选择鉴定 (六)回输体内,6,四、基因治疗的现状与展望,基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾
4、病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。 基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源-异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。基因,7,治疗研究一般要符合下列要求,为已明确了的单基因缺陷疾病； 仅限于体细胞； 靶细胞的亲缘性和可操作性等； 有明显疗效和无或低危害性等； 表达水平稳定时程长； 必须有动物实验基础。,8,参考资料（2008.2）,1.基因诊断和基因治疗在我国临床应用的情况如何？ 基因诊断方面在我国，目前基因诊断在以下几个方面已进入临床实
5、用阶段。 （1）遗传病的产前诊断。通过基因诊断，可检测胎儿性别，这对与性染色体有关的遗传病的诊断是十分必要的。对于高发性的遗传病，如地中海贫血、镰刀状贫血、凝血因子缺乏等基因诊断已在临床应用多年，为优生优育作出了贡献。 （2）致病病原体的检测。当致病病原体进入人体后，可引起相应的疾病。当我们了解其核酸序列后，就可以设计引物和探针，通过基因检测进行诊断。目前已应用于病毒（乙肝）、细菌（结核）、原虫（梅毒螺旋体）等病原体的检测。,9,（3）癌基因的检测和诊断。通过研究，人们已阐明部分癌症基因与癌症之间的关系。目前，在临 床上可以用基因检测方法诊断白血病、肺癌、神经胶质瘤等疾病。除此以外，基因诊断技
6、术还广泛应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等司法鉴定，以及动 植物检疫与转基因动植物中阳性基因的检测等方面。 基因治疗方面我国是世界上较早开展基因治疗研究的国家之一。1991年，我国科学家进行了世 界上首例B型血友病患者的基因治疗临床试验。目前已有4名血友病患者接受了基因治疗，治疗后体内IX因子浓度上升，出血症状减轻，取得了安全有效的治疗效 果。此后，我国科学家利用胸腺激酶基因，对恶性脑胶质瘤进行基因治疗的方案，已获准进入I期临床试验。初步的观察表明，生存期超过1年者占55%，其中1 例已超过三年半，至今仍未见肿瘤复发。此外，采用血管内皮生长因子基因，对外周梗塞性下肢血管病进行基因治疗的
7、方案，也已获准进入临床试验。目前，我国已 有6个基因治疗方案进入或即将进入临床试验。 我国的基因治疗研究在建立高效、靶向性基因导入系统等关键技术方面取得重大进展，如靶向性非病毒载体和腺病毒伴随病毒载体系统的建立，具有国际前沿水平和自主的知识产权。,10,2.如何实施产前诊断？产前诊断对胚胎有没有不良影响？ 产前诊断方法可分为三类五个水平。 第一类是采用特殊仪器检查胎儿体表是否有畸形，例如，用X线照片、体表造影或B超等进行间接观察；或在胎儿镜下进行直接观察。此类检查属形态学水平。 第二类是采用母体血、尿等特殊检查，间接诊断胎儿先天性疾病。在母体孕期，少量胎儿血细胞、 可扩散的代谢产物，以及蛋白质
8、和酶等物质，可通过胎盘进入母体血液循环系统，这是母亲的血、尿可作某些疾病产前诊断的基础。例如，测定孕妇血甲胎蛋白 （AFP），可诊断胎儿神经管畸形（NTD），测定孕妇尿甲基丙二酸，可诊断胎儿甲基丙二酸尿症。 第三类是直接获取胎血、羊水或胎儿组织来诊断胎儿疾病。 三类检查方法，可以从形态学、染色体、酶学、代谢产物和基因等五个水平，进行产前诊断。 产前检查基本没有不良影响。,11,3.什么是基因治疗的体内治疗？什么是基因治疗的体外治疗？什么是体细胞的基因治疗？什么是生殖细胞的基因治疗？ 基因治疗的体内治疗：即直接将基因导入体内的治疗方法。可分为：（1）异位导入，将基因导入非病变的细胞，如皮下，肌肉
9、等；（2）原位导入，将基因导入直接病变的部位，如肿瘤细胞、骨髓细胞等。 基因治疗的体外治疗（回输）：即将病人的部分组织或细胞取出，在体外培养导入基因后，再回输入体内。 体细胞基因治疗：是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体的特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。 生殖细胞的基因治疗：是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞）或中早期胚胎，使 其可以发育成正常个体。显然，这是理想的治疗方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰，至今尚无实质性进
10、展。基因的这种转移一般只能用显微注射法，然而这种方 法效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。而在人类中将基因转移到生殖细胞，并使其世代遗传，又会涉及到伦理学问题。因此，就人 类而言，目前多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。,12,一、基因治疗的策略,内容提要,二、基因转移技术,四、治疗基因的受控表达,三、基因干预,五、基因治疗的应用研究,13,一、基因治疗的策略,The Strategy of Gene Therapy,14,（一）基因置换（gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,
11、目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,15,又称为基因打靶(gene targeting） 定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。,基因同源重组技术,16,要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。,定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。,17,（二） 基因添加,基因添加或称基因增补（gene augment
12、ation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,18,（三）基因干预 基因干预（gene interference）: 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,19,（四）自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代
13、谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,20,自杀基因的作用机制,21,TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。,CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自杀基因系统,22,旁观者效应:“自
14、杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。,2. 旁观者效应,23,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,24,二、基因转移技术,The Technique of Gene Transfer,25,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,26,基因转移(gene transfer)技术：,1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。,27,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体介导的基因转移效率较高，因此
15、它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,28,Retrovirus,（1）逆转录病毒,29,30,（1）两端各有一长末端重复序列LTR。,逆转录病毒前病毒的结构特点,（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。,（3）病毒有三个结构基因,（4）5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。,（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。,(1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)
16、在R内还有poly(A)加尾信号。,(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； (2)pol基因，编码逆转录酶； (3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,31,32,逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成：,(1) 逆转录病毒载体,(2) 辅助细胞株(如PA317),33,Retroviral packaging system,34,逆转录病毒载体的特点,逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,35,逆转录病毒载体的主要缺点,随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。,36,（2）腺病毒(adenoviru
