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1、第十四章基因重组与基因工程,基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA,第一节、自然界的基因重组,转化：transformation 整合：integration 转导：transduction 转位：transposition,转化,转化： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。,细菌的转化,转化,病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。,转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。,细胞的转化,整合,整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可
2、与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。,整合,溶原和裂解可以相互转变。,转导,溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 来源于宿主的基因称转导基因。,转位,转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。 这些游动的基因称为转位子(transposon)。,转位,第二节、基因工程,基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为
3、重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。 分子水平上操作，细胞水平上表达。 赋予重组DNA以新的生命力。,基因工程,肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。 已经证实GnT-与转移有关。,转入GnT-基因,肝癌细胞株SMMC7721,观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为,转入反义GnT-基因,转移,转移,基因克隆,分 切 接 转 筛,载体和目的基因,载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。 常用的载体有： 质粒、
4、噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。,质粒,质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。 拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。 质粒的性质： 易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 有一个限制性内切酶切口。,质粒,pBR322：常用的质粒,噬菌体载体, 噬菌体 、 M13 噬菌体 易于感染大肠杆菌 噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。 一个切口：插入型载体。 二个切口：置换型载体。,噬菌体载体,目的基因的来源,直接从染色体DNA中分离：
5、原核生物 人工合成：简单的多肽 从mRNA合成cDNA：真核生物 基因文库：(gene library） G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。,从mRNA合成cDNA,限制性内切酶的应用,限制性内切酶可辨认46个核苷酸：回文结构 回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。 平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端) 粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。,限制性内切酶的应用,Alu I .AGCT. .AG CT. 平端 .TCGA. .TC GA.,Bam
6、H I GGATCC .G GATTC 粘性 .CCTAGG CCTAAG G 末端,限制性内切酶的应用,切载体,切目的基因,限制性内切酶,相同粘性末端,两者相连,要点：避免切断目的基因,载体和目的基因的连接,人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。 DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。 连接方式： 粘端连接方式 尾接法,粘端连接,尾接法,重组体的转化,基因的转移： 重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。 化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体,重组体的转化,转
7、化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。,基因工程的表达体系的发展,DNA重组体的筛选与鉴定,根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型 DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。,DNA重组体的筛选与鉴定,灭活法筛选重组体。,提取转化细胞DNA,限制性内切酶,琼脂糖凝胶电泳,与原来载体及重组体比较,DNA重组体的筛选与鉴定,DNA重组体的筛选与鉴定,菌落,硝酸纤维素滤膜,探针,X线底片,显影,平板,基因工程策略,第三节
8、、基因工程的应用,生命科学研究趋势 基因诊断和基因治疗 基因工程产品的开发和应用,生命科学研究趋势,基因的结构与功能研究 基因表达的调控 各种生物大分子之间的识别及结合 了解生命的奥秘,基因诊断和基因治疗,基因工程产品的开发和应用,基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、 基因工程生产激素类： 胰岛素、生长激素 细胞因子： 生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素,第五节、聚合酶链反应,聚合酶链反应：PCR polymerase chain reaction 耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在7080有很高的催化力。 原理：以目的DNA为模板，快速合成大量的DNA，用于检测、制备、研究。,第五节、聚合酶链反应,变性： 95 、15s 引物粘合：55 、30s 引物延伸：72 、1.5m,
