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1、第二章 菌种培养 第一节 微生物的生长 一. 生长现象和繁殖方式 这里指微生物的群体生长，包括个体生长和个体繁殖，在发酵工业中，应用最多的是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌 1. 细菌（bacteria） 单细胞原核生物，主要靠分裂繁殖,细菌分裂图,2. 放线菌 单细胞丝状，主要靠无性孢子进行繁殖（图）,3. 酵母菌 单细胞真核生物，出芽繁殖和子囊孢子繁殖 （出芽）,酵母菌子囊孢子,4. 霉菌 单细胞或多细胞丝状真菌，发酵工业中应用最多的是青霉、曲霉、毛霉、木霉等（图）,二. 生长的测定 微生物的生长和产物的生成有着密切的关系，因此测定生长对发酵的控制很重要 1. 测定细胞的数目 1）浊度计比浊法
2、2）计数器记数法 对于单细胞的微生物或微生物的孢子比较准确，对于菌丝体比较困难,2. 测定细胞重量 1）细胞干重称量法 2）细胞堆积容积测量法 3）细胞组成分析法 ：蛋白质 DNA RNA 4) 营养物消耗分析法：测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物，如磷酸盐、硫酸盐等 5）产物重量分析法：测定培养中形成的CO2、ATP和H2等,三. 群体生长规律（典型细菌生长曲线） growth curve（图）,1. 延滞期（lag phase） 是微生物生长过程对外界的适应期 个体重量增加，体积增大，活菌数为增加 原生质均匀，嗜碱性强，RNA含量高，酶类的合成和诱导 菌体对外界物理、化学因素的抵抗力弱
3、，“幼龄期”，代谢活跃 发酵生产中，早期保证营养和氧气，使幼龄菌很好生长,2. 对数生长期（log phase） 细胞的代时（generation time）最短且恒定，群体细胞以几何级数增加，单位时间内细胞数目或细胞重量的增加（生长速率）恒定 细胞分裂产生的所有菌都是活菌，总菌数与活菌数接近相等 细胞的形态、生理特征一致 在发酵工业中要设法延长此期，获得更多的活细胞（？）,3. 稳定期（stationary phage） 菌体的世代时间加长且不稳定，活菌数的增加与死菌数的增加接近平衡（原因？） 如果出现溶菌现象，总菌数将下降 溶菌的结果，使培养基变的更加复杂，导致培养物缓慢地二次生长 原生质
4、内出现贮藏物质，如糖原、异染颗粒、脂肪粒等，液泡，芽孢 稳定期内代谢活动在进行，大量的初级和次级代谢产物主要在此期形成（延长？）,4.衰亡期（decline or death phase） 总菌数可以恒定，但活菌数逐渐减少 细胞容易出现多形态，包括畸形，最后菌体自溶死亡 在发酵工业中，由于活菌数大减，产物产生少，甚至破坏多，菌体自溶影响产物提取，及时结束发酵（？） 霉菌和放线菌在发酵液中呈絮状菌丝体，在不断搅拌下均匀分布在发酵液中，生长规律不典型,第二节 微生物生长的动力学 研究微生物生长速率、营养物消耗速度、产物生成速度及其相互关系 研究影响反应速率的因素 为获得理想的发酵参数、小型实验数据
5、的放大、发酵生产设备的合理化和提高生成率提供理论依据 生长动力学和产物生成动力学两部分组成 比生长速率和比产物生成率是重要参数,一. 比生长速率（specific growth rate） 1. 分批培养的比生长速率 当微生物处在最高的生长时期，培养基中营养物过量，此时生长速率与营养物浓度无关，而与细胞浓度有关，其关系表现为微生物细胞浓度（以重量表示）的瞬时增长速率dX/dt和培养液中微生物细胞浓度X成正比，或任一瞬间生长速率与细胞浓度成正比,dX/dt=X （1） X: 每毫升培养液中细胞的数量 t：培养时间（h） ：比生长速率，即每单位数量的细菌或物质在单位时间内（h）增加的量 对（1）式
6、积分，得 lnNt-lnN0=(t1-t0) 换成以10为底的对数 lgNt-lgN0=(t1-t0)/2.303,Nt与N0分别代表t和t0时的细胞数量，测定从N0增加到Nt所用的时间和Nt与N0的量，就可以求出该条件下的 如N0时每ml培养液中细菌数为104，经过4小时后该培养液中细菌的数目增加到108，求此条件下细菌的比生长速率（ ） =(lg Nt -lg N0 )/(t1-t0)2.303 =(8-4)/4 2.303/h =2.303h 代表在该条件下，每个细菌以每小时增加2.303个细菌的速度增加,：细胞浓度的瞬时增大速率和细胞浓度的比例常数 单位重量菌体的瞬时增量 重量：g 时
7、间：hr : 菌体的增重数/hr.g, g/g.hr,二. 生长的营养条件及其选择 （一）营养物的影响和选择 1. 营养物对生长的影响 1）微生物所需的营养物： 2）分析细胞的化学组成分析对营养物的需要 3）满足营养需要，微生物才能正常发育 4）营养物种类对微生物生长的影响，主要表现在对生长速率的影响,速效性氮源： 速效性碳源： 迟效性氮源： 迟效性碳源： 5）对繁殖的影响，如不同碳源对Aspergillus niger产孢的影响 6）微生物在单一碳源上和多种碳源上生长时的差异 单一碳源 二种碳源 多种碳源,2. 营养物浓度对生长的影响 对生长速率的影响和生长的抑制上 当营养物浓度达到一定值，
8、生长速度达到最高，在特定的温度、pH、营养物种类和营养物浓度等条件下，分批培养的比生长速率是常数 营养物浓度过大，微生物的生长受到抑制 营养物浓度太高时，对微生物细胞具有毒害作用,营养物浓度和生长速率之间的动力学关系：Monod模型 = maxS/Ks+S :比生长速率（1/h） max：最大比生长速率（1/h） S:：营养物浓度 克/L Ks：饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L,微生物生长的Monod模型,Ks是使达到最大比生长率max值一半时的营养物浓度, 当一种限制性营养物浓度S大大低于Ks时， =maxS/Ks，即很小，此时生长很慢 当S=Ks时，=0.5 max，随营养
9、物浓度增加，相应增加，逐渐趋向max，成为营养物浓度的重要函数，此时营养物浓度仍是生长的限制因素，在Monod模型上表现为曲线,当营养物浓度S大大高于Ks时，营养物浓度不再影响微生物生长，即S的变化不再成为生长限制因素，此时，接近max，在Monod曲线上表现为直线 在分批培养时，Ks表示微生物对营养物的亲和力，在一定营养条件下，Ks越小，微生物对限制性营养物的亲和力越大，限制性营养物的浓度必须降低到十分低的水平，才能影响微生物的生长，Ks越大，亲和力越小，即使限制性营养物浓度很高，生长率也下降,3. 营养物比例对生长的影响 C/N比 不当，会影响菌体对按比例吸收营养物 不当，改变原来合适的p
10、H环境 氮源不足，表现为菌体繁殖慢，碳源不足表现为菌体容易衰老 生理酸性盐和生理碱性盐的比例也会影响微生物生长的pH环境,4. 发酵过程中营养条件的选择 种子质量和发酵初期菌体生长的控制，对发酵是非常重要的 比生长速率最大，延长对数期长，获得更健壮的菌体 在影响的诸多因素中，营养条件最为重要 1）营养物种类 2）营养物比例 3）营养物浓度：对易被吸收的限制性营养物浓度的控制很重要，充足而不过大，过大，对生长的抑制,（二）溶解氧的影响和选择 氧对好氧和厌氧微生物非常重要 氧在培养液中的饱和浓度只有(0.0032mg/L) 发酵中消耗溶解氧 0.32-0.8mg/L/h 培养液中的氧只能维持微生物正常呼吸14-36秒,1. 溶解氧浓度对生长的影响 氧、水和二氧化碳进入细胞是靠扩散作用，培养液中溶解氧和细胞内溶解氧之间的浓度差是氧扩散的动力 在营养物限定的情况下，溶液中溶解氧的浓度是主要因素，溶解氧浓度与呼吸强度密切相关,
