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1、紫外可见分光光度计,主要内容,1、工作原理及仪器组成 2 、分光光度计的使用 波长扫描 定量测定 3 、注意事项,互 补 色 原 理,植物叶子呈现绿色是因为植物中存在一种吸收蓝紫光和红光的载体叶绿素,颜色的产生,利用一定频率的紫外-可见光照射分析物，它将有选择地被吸收。吸收光谱可以反映出物质的特征。,溶液对光的作用示意图,物质对光的选择性吸收溶液对光的作用,I0 入射光辐射强度 I 透射光辐射强度 T 透射比 a 吸光系数 摩尔吸光系数,光吸收遵循朗伯-比尔定律：,溶液对光吸收过程,仪器组成- 单光束分光光度计,双光束分光光度计,组成：光源、单色器、样品池、检测器 1光源： 能提供连续的辐射；
2、光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。钨灯可见光区 3202500nm 氢灯或氘灯紫外光区 195375nm U3010（碘钨灯、氘灯）波长范围190-900nm,2单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是： 入射狭缝限制杂散光进入。 色散元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。 准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 出射狭缝只让特定波长的光射出单色器。,3. 吸收池 玻璃由于吸
3、收紫外UV光，仅适用于可见光区； 石英适用于紫外和可见光区 4检测器：将光信号转变为电信号的装置 光电管 光电倍增管 二极管阵列检测器 5记录装置：讯号处理和显示系统,Slit 1不存在，Mirror取代了光栅grating 1 Grating2 variable-pitch aberration-corrected diffraction grating 旋转镜将光分成两束，分别通过参比池和样品池，然后聚集在PMT,二 分光光度计的使用-波长扫描,启动UV Solution软件,打开仪器主机电源。用鼠标点击Windows开始菜单中的Hitachi Applications选项中的UV Sol
4、utions 2.0 选项。或者直接在桌面上双击UV Solution图标。,2运行UV Solution软件。软件将自动配置计算机的串行口（RS 232 Port）见图,仪器在初始化过程中进行如下自检工作： ROM检测 RAM检测 波长步进电机运转检测 氘灯点亮检测 钨灯点亮检测 仪器波长校正,3 仪器主机开始初始化。见图,4 仪器主机初始化完毕，进入工作状态。,5 测量参数设置,1 在Edit菜单中选择Method选项，或按按钮。出现下列窗口。,General:总体设置页面 Measurement测量: Wavelength scan 波长扫描 Time scan时间扫描 Photomet
5、ry 定波长测量 Operator操作者: 输入操作者的姓名 Instrument仪器:仪器型号由软件自动从仪器主机获得。 Use Sample Table使用样品表:选择是否使用样品表。 Comments备注:填写一些备注信息。 Load按钮:用于装载原来保存的方法文件。 Save按钮:保存当前的设置参数。 Save As按钮:将当前设置参数另存为一个方法文件。,Instrument仪器参数设置页面,Data mode读数显示方式，选择Abs吸光度，波长扫描的起止范围一般为190-800，狭缝值一般为2 Light一般选择“Auto”,Monitor显示页面,Processing数据处理页面
6、,Report报告结果页面,样品名设置，备注信息及文件名输入,基线校正,用户基线校正方法：可将scan speed 设小一些；进行样品扫描时，可设大一些。 将空白样品分别放入样品室的参比光路和样品光路。按按钮 系统基线校正方法。 使用空气作为参比和样品。按按钮 出对话框见图，选择System后按OK按钮，进行系统基线校正。,测量,有两种方法可以开始测量： 使用菜单方式 选择Spectrophotometer菜单下Start选项开始测量 使用按钮方式 ：按按钮 开始测量 如果要终止扫描按按钮 。,二 分光光度计的使用-光度法,测量参数设置,在Edit菜单中选择Method选项。出现下列设置窗口.
7、,具体操作程序,Method: general:Measurement测量方式选择Photometry（光度计测量） Quantitation定量参数设置页面：,在measure中选择波长wavelength，在Calibration中选择“1st order”， “2st order”， “3st order”，也可以不校准。在concertration中键入标准浓度单位。 3. Instrument,4 standards标准参数设置 键入标系的样品浓度及名称,5 吸光度自动校零 在开始测试前，需要进行吸光度校零。在样品室参比和样品光路中分别放入空白样品。按按钮 进行吸光度校零。 6 在w
8、avelength中设定扫描的最大吸收波长， 7 放入标样，选中第一个标样，点measure依次测定完成 后自动给出标准曲线。 8 选择SAMPLE进行样品测定，全部测定完后点击END，此 时自动生成一个文件，打开此文件，另存为所需的文件名。 9 关机时，先退出UVsolution，再关电脑，最后关光度计上的power。,三 注意事项,1. 开机预热15分钟左右。 2. 测定时应注意： 参照池和吸收池应是一对经校正好的匹配的吸收池，材料和规格一致。 使用前后应将洗手池洗净，测量时不能用手接触窗口。 已匹配好的比色皿不能用炉子和火焰干燥，不能加热，以免引起光程长度上的改变。,3. 测量条件的选择
9、： 选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,必须选择溶液最大吸收波长的入射光。 控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.20.7读数范围内时,测量的准确度较高. 选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作零点的。若样品溶液，试剂，显色剂无色可用蒸馏水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液。 4. 用完后先关程序，再关仪器开关，关电源，关闭计算机。 5. 正确登记，将仪器及实验台擦干净。,思考题,分光光度计由哪几部分组成？设计其光路图。 紫外可见分光光度计对光源的要求是什么？ 一般采用哪几种光源，各光源的波长范围是什么？ 比色皿一般由什么材料制成？有哪几种规格？做实验时，你是如何选择比色杯的规格及材料的？ 为什么测定时使用参比池？参比溶液怎么选择？ 在进行波长扫描与光度测定时需要设置哪些参数？,谢谢大家,
