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1、第七章 常用分子生物学技术,第一节 基因工程 第二节 PCR技术,第 一 节 基因工程 Genetic engineering,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程,一、基本概念,1、基因工程,2、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,GGATCC CCTA
2、GG,G CCTAG,GATCC G,+,Bam H,3、基因载体,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 粘粒DNA,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,二、工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 多核甘酸激酶等,重组DNA技术中常用的工具酶,三、重
3、组DNA技术的基本原理,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆 。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,第二节 PCR概述,PCR技术的创建,故事发生在1983年的春夏之交,Kary B. Mullis (1944 -)PCR的发明人,PCR: Polymerase Cha
4、in Reaction,Kary B. Mullis（1944）,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬 Mull
5、is在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis
6、的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR不只是一个方法改进,Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；
7、到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,PCR技术与体内DNA复制的区别：,1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；,2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。,一、PCR的定义,在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。,二、PCR 原理,
8、1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变性,引物退火,延伸,PCR技术原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA变性：加热至94左右，双链DNA解离成单链； 模板DNA与引物的退火(复性)：55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链； 重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。,72,94,55,PCR循环,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环退
9、火,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR整个过程,PCR product,三、PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液
10、 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,循环仪,94 55 72 ,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 57 min,循环2535次,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白
11、类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
12、 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,经典循环参数（
13、500bp以内）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,四、PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知D
14、NA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,可用于检测特定基因序列的存在或缺失。,指在同一个PCR反应体系中加入两对以上的引物，同时扩增一份DNA样品中不同基因位点的不同序列。,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）,逆转录酶,
15、聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,6) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,7）重组PCR 将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。 即先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物进行PCR扩增。所得到的产物是一个重组的DNA.,五 PCR反应特点,（一）特异性强,靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。,（二）灵敏度高,PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为3个细菌,（三）简便、快速,在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般13 小时完成。,（四）对模板的纯度要求低,可直接用临床标本如血
