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1、Molecular Biology,Biotechnology Institute Hu Dongwei ,第三章 DNA的复制,一、半保留复制 Semi-conservation replication,以每条链为模板，按碱基互补配对原则由DNA聚合酶催化合成新的互补链。,二、复制起点和复制子 Origin of replication (ori) and replicon,DNA复制从特定位置开始，即复制起点，然后向两边进行复制。 原核生物DNA分子为一个复制子；而真核生物每个DNA分子有多个复制子，每个复制子长约50-200kb。,二、复制起点和复制子 Origin of replica
2、tion (ori) and replicon,复制起点有特殊的序列结构： A. 反向重复序列，即回文结构(palindrome)，与复制酶系统的识别有关； B. 启动子序列。 C. 呼吸区序列,三、半不连续复制 Semi-discontinuous replication,DNA生物合成方向为53延伸合成。 在复制起点向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。 前导链(leading strand)的合成是连续的；后续链(lagging strand)以冈崎片段(Okaxaki fragments)的形式分段合成，再连接。,四、参与DNA复制的酶与蛋白,螺旋酶 (Hel
3、icase) 利用ATP的能量，促使DNA在复制叉打开为单链。 E. coli中一种为螺旋酶I或螺旋酶III，与后续链的模板DNA结合沿53方向运动；第二种为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿35方向运动。,2 单链DNA结合蛋白(SSBP),E. coli的SSBP为四聚体，可结合32 bp。 SSBP使单链DNA呈伸展状态，有利于单链DNA作为模板。 SSBP防止单链DNA重新配对或被降解。,催化DNA不同超螺旋状态之间的转变。 A. 拓扑异构酶I ：双链解旋 切断形成“酶-DNA“共价中间物 DNA连接。不需辅助因子。 B. DNA旋转酶(DNA gyrase)：拓扑异构酶II，引入
4、DNA分子负超螺旋 。需要ATP。,DNA拓扑异构酶 (Topisomerase),4 引物酶 (Primase) DNA的复制需要RNA引物。E. coli引物酶由dnaG基因编码，60KD，单细胞50-100个分子。 在某些单链噬菌体和质粒DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。,引物酶与一般RNA聚合酶的区别： （1）对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感； （2）可以利用核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种底物； （3）只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制。,5 DNA聚合酶 (DNA Polymerase, DNA Pol),基本特性： （1）以 dNTP为底物催化合成DN
5、A； （2）需要模板和引物； （3） DNA合成的方向是5 3 。,109kD多肽，每个细胞有约400分子。 模板专一性和底物专一性均较差。 除了聚合酶活性外，DNA Pol I酶还具有： （1）35外切酶活性 （2）53外切酶活性 DNA聚合酶活性和53外切酶活性协同作用，可以进行缺口平移(Nick translation)。,AE.coli DNA聚合酶 I (DNA pol I),120 kD，每个细胞约有100个酶分子，活性为DNA Pol I的5%。 催化特性： (1)补平作用：最适模板为双链DNA中间有空隙的单链DNA部分； (2)具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。 (3)
6、可能在DNA的损伤修复中有一定作用。,BE.coli DNA聚合酶 II (DNA pol II),DNA复制所必需的酶；多种亚基，每个细胞中10-20个分子。 具有35和53外切酶活性。35外切酶活性的最适底物是单链是DNA；53外切酶活性要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。,CE.coli DNA聚合酶 III (DNA pol III),(1) DNA聚合酶a，300kD，4或5个亚基组成，占总量的80-90%，主要负责染色体DNA的复制。 (2) DNA聚合酶b，45kD，单链，主要修复核内DNA。,D真核生物的DNA聚合酶,(3) DNA聚合酶g，140k
7、D，负责线粒体DNA的复制。 (4) DNA聚合酶，与原核生物的聚合酶类似，具有35核酸外切酶活性。 除了DNA聚合酶，其它DNA聚合酶均没有35或53外切酶活性。,DNA polymerases in human and SV40,6 DNA连接酶 (DNA lygase),催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 (1) 大肠杆菌的DNA连接酶 75kD，对胰蛋白酶敏感，每个细胞中约有300个分子。在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。 (2) 噬菌体T4 DNA连接酶 60 kD，需要ATP。 可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘
8、性末端或平头末端。,A原核生物,真核生物DNA连接酶有两型，连接酶I和II。需要ATP参与提供能量。 DNA连接酶I 约为200kD，主要存在于生长旺盛细胞中； DNA连接酶II 约85kD，主要存在于生长于不活跃的细胞(resting cell)中。,B真核生物 DNA连接酶,五、DNA复制过程,1 复制的引发 (Priming),包括DNA复制起点双链打开，RNA引物的合成，DNA聚合酶聚合反应开始进行。 转录激活(transcriptional activation) ：RNA聚合酶沿后续链模板转录一短的RNA分子，分开DNA双链；特定序列与引发体结合，并在前导链模板DNA上开始合成RN
9、A引物的过程。 前导链(leading strand)的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质参与，如大肠杆菌的dna A蛋白。,五、DNA复制过程,1 复制的引发 (Priming),包括DNA复制起点双链打开，RNA引物的合成，DNA聚合酶聚合反应开始进行。 转录激活(transcriptional activation) ：RNA聚合酶沿后续链模板转录一短的RNA分子，分开DNA双链；特定序列与引发体结合，并在前导链模板DNA上开始合成RNA引物的过程。 RNA引物可能与减少DNA复制起始处的突变有关。,引发过程： DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开 合成RNA引物分子，分开双链D
10、NA链 单链DNA结合蛋白(SSB)结合在被解开的链上 复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n蛋白)，n“蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，与单链DNA结合生成中间物 引发前体与引物酶(primase)组装成引发体(primosome) 引发体在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置 引发体首先在前导链上合成RNA引物，然后在后续链上沿53方向不停的移动，在一定距离上反复合成RNA引物。,DNA复制的延伸,由DNA聚合酶III催化,正超螺旋的解除 （1）DNA解链而产生正超螺旋可以被原来存在的负超螺旋所中和；
11、（2）DNA拓扑异构酶I可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；而DNA拓扑异构酶II（旋转酶）可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链。 DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶III催化，由7种多肽组成。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。亚基具有聚合功能和53外切酶活性，亚基具有35外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。 在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶III在同一时间分别进行复制DNA前导链和后续链。如果
12、后续链模板环绕DNA聚合酶III全酶，并通过DNA聚合酶III，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则后续链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。,当DNA聚合酶III沿着后续链模板移动时，遇到RNA引物后就开始延伸合成。到达前一冈崎片段时停止。复制叉继续向前运动，产生了又一后续链冈崎片段。 DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶III全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体。复制体在DNA前导链模板和后续链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的后续链。 在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶III的作用。当冈崎
13、片段形成后，DNA聚合酶I通过其53外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由53合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA后续链。,DNA复制的终止,DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合I所填充。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少。线性DNA分子两端是靠端粒酶完成其复制。,六、DNA复制的真实性,大肠杆菌中，每复制109-1010个核苷酸便要出现一个误差。每1000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正常的核苷酸。如果单纯靠碱
14、基对原则来维持其DNA复制准确性的话，那么误差出现的频率将为10-4-10-5。因而，在细胞内除了碱基对原则外，必然还有其他因子的作用，来维持DNA复制的准确性。,DNA聚合酶本身具有校对作用 按碱基配对原则，错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5，然后，DNA聚合酶本身的校对作用又可以使错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只有10-8-10-10。 引物RNA的切除 DNA复制开始时掺入的核苷酸往往容易出错。RNA引物可以被切除，不会影响DNA的准确性。 真核生物DNA聚合酶无35外切酶活性。因此，可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。,
15、七、环状DNA的复制的方式,1型复制 环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成样中间物，故又称型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。,2D环复制 (D-loop) 线粒体DNA的复制属于D环复制，即两条链的复制不是同步的。 （1）H链首先合成：在复制起点处以L链为模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一个500-600bp长的H链片段。该片段与L链以氢键结合，将亲代的H链置换出来，产生一种D环复制中间物。 （2）H链片段的继续合成：上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，这
16、需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。 （3）L链合成开始：以被置换下来的亲代H链为模板开始合成L链DNA，合成也需要RNA引物。 （4）复制的完成：H链的合成提前完成，L链的合成随后结束。线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要1个小时。刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的，需要40分钟将其变成超螺旋型。,2滚环复制(Rolling circle) 亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5端游离出来并且很快被单链结合蛋白结合。同时环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸。 在DNA解链时不会产生超螺旋。当5-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA
