{企业组织设计}农作物组织培养

《{企业组织设计}农作物组织培养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《{企业组织设计}农作物组织培养（104页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第八章 主要农作物的组织培养,以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且周期长 植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面 离体无性系的快速繁殖 培养无病毒种苗 新品种的选育 人工种子和种质的保存。,第一节 农作物组织培养的意义、方法与应用,对繁殖系数低的“名、优、新、奇、特”植物品种的推广，兰花、安祖花、马蹄莲、甘薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、非洲菊等经济植物已开始工厂化生产 植物脱毒苗木培育 脱毒后的马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉等植物可大幅度提高产量，改善品质，兰花、水仙、大丽花等观赏植物脱毒后植株生长势强，花朵变大，产花量上升

2、，色泽鲜艳 植物新品种培育 基因工程育种（抗虫棉、抗除草剂大豆、玉米），单倍体育种-烟草单育1号、水稻“中花8号”、小麦“京花1号”，远缘杂交幼胚早期培养，原生质体融合技术，选择细胞突变体 植物种质资源的离体保存 超低温离体保存植物种质，可节约大量的人力、物力和土地，还可挽救那些濒危物种,人工种子 为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段,第二节棉花组织培养,一、大量元素（20倍）母液 (g/L),二、微量元素（100倍）母液 (g/L),微量元素二级母液（即我们平时配培养基时使用的微量）：取上述母液200ml，母液50ml，加蒸馏水定容至1L。,铁盐母

3、液配制（所用试剂均为国药产品） B5有机物配制 （所用试剂均为sigma产品）,各种激素配制（所用试剂均为sigma产品）,愈伤组织的诱导 0.5-1cm的下胚轴切段接种于诱导培养基上，一个皿放25-30段下胚轴。一个月后挑选两端膨大，生长正常的下胚轴继代到新的IBA培养基上 非胚性愈伤组织的增殖 由于愈伤组织的进一步膨大，一个皿中以20段下胚轴为宜 愈伤组织的分化 愈伤组织经继代（一个月继代一次）几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上，进一步分化成胚状体 成苗生根培养 将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上 炼苗移栽 将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2

4、-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田,棉花下胚轴组织培养过程,棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生,A1：下胚轴外植体；A2-A4：胚性愈伤组织在腺体处发生；B1：愈伤组织表面的胚性细胞；B2-B4：愈伤组织表面形成胚性组织,棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生,A：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚(箭头所指)；B：具胚柄的多细胞原胚(箭头所指)；C：具胚柄的体胚；D-G：与愈伤组织粘连的体胚；H-I：游离的体胚,棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育,A：培养当天；B1-B2：培养7 d；C1-C3：培养14 d；D1-D3：培养21 d后出现球形胚

5、；E1-E3：心形胚阶段；F1-F3：鱼雷形胚阶段；G1-G3：子叶胚阶段,棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化,A：球形胚表皮原形成； B：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；C：内部等轴细胞轴向延长形成的心形胚；D-E：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；F-G：具有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；H：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；I：具有Y形微管组织的子叶胚,棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚,A1-A6：球形胚；B1-B6：心形胚；C1-C6：鱼雷形胚；D1-D6：子叶胚,第三节 水稻花药和花粉培养,目录,研究进展 研究过程

6、研究意义 前景展望,一 研究进展,1.水稻单倍体获得途径 花药培养、花粉培养 胚珠或子房培养（未受精）,概念： 单倍体育种：通过花药、花粉培养获得单倍体，然后进行染色体加倍，经过选择、鉴定选育出新品种的途径。 花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。,花粉培养：是将花粉从花药中分离出来,接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。,水稻花培历史： 1968年，日本人新关和大野首次通过水稻花药培养获得单倍体植株； 1970年，我国正式开展水稻花药培养技术研究，并取得良好进展； 截至目前，已有多个品种

7、通过花培途径获得。代表成果：天津农科院选育的花育“花育1号”、“花育2号”；中国农科院选育的中花系列；黑龙江农科院水稻所选育的龙粳系列品种。,截至目前，通过花培选育出了很多粳稻品种并大面积的推广应用。1975-1998共审定26个品种。 籼稻花药培养难度较大。至20世纪末，共有5个品种通过花培选育。,二 研究过程,1.培养流程 2.培养方法 3.影响因素 4.检测方法,1.培养流程,花药和花粉培养基本流程：,2.培养方法,花药培养 1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.

8、1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。,水稻花药培养由接种至长出愈伤图,花粉培养 与花药不同，花粉培养需进行花粉的分离与纯化及特殊的花粉诱导培养。,分离和纯化方法 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 3、机械游离 （1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； （2）超速

9、旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子,小孢子梯度离心前后比较,花粉培养方式 1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 6、条件培养基培养 利

10、用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。,3.影响因素,（1）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻，且在同一亚种范围内，不同品种间也存在很大差异。,（2）培养基和激素配比选择 应用于水稻花培的基本培养基种类较多， 如N6、 马铃薯培养基、 L8、 SK3、 土豆培养基、Miller、 合5、 通用、 LS、 White、 MS、 M8和改良M8等。同一材料用不同的培养基培养， 表现出不同的花培效果。,培养基 三明市农科所生物技术中心以M8、

11、 N6和NB培养基， 进行了不同水稻品种材料花培观察比较试验， 结果从出愈率、 绿苗分化率两者比较， 还是M8 培养基较适合。 冯双华等用M8、 合5和改良M8做基本培养基， 以籼型杂交稻两优培九、 培两优288、 P88S/0293为材料， 得出改良M8培养基表现出对不同的基因型材料有较广的适应性和较强的绿苗诱导作用。,激素配比 生长素类一般有2,4-D、 NAA、 IAA等， 细胞分裂素一般有6-BA、 KT等。 使用倾向：复合激素 冯双华等提出籼型材料用1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/LNAA诱导效果较好， 2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+0.25 m

12、g/L IAA分化效果较好。,郭书巧等提出对籼粳交材料2 mg/L 2,4-D+1 mg/L NAA+0.2 mg/L KT为最佳的激素诱导配比， 2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT分化效果较好。 结论：基因型不同，最适激素配比不同。一般认为，对籼型水稻采用复合激素较好。,（3）田间取样与预处理 取样时间：晴天8:0010:00， 或16:0018:00 取穗标准： 穗苞大而不破，剑叶与下一叶的 叶枕距为510 cm为宜 低温处理：一般认为58度条件下， 低温预处理810d较好 此外，还有其它处理方法：化学物质、射线、离心等。,（4）培养条件 温度、光照、密度,4.检测方法,1

13、、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。 2、间接鉴定 （1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。,（4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）,三.研

14、究意义,1.缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而花培仅需一年。,2.提高了目标基因型的选择效率 例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。,ABaBAbab ABAABBAaBBAABbAaBb aBaABBaaBBaABbaaBb AbAabBAabBAAbbAabb abaAbBaabBaAbbaabb,2.提高了目标基因型的选择效率 例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4

15、。,3.有利于隐性基因控制性状的选择 4.与生物工程技术结合，对育种学及遗传基础研究都有很重要的意义。,四.前景展望,1.供体植物生长条件的进一步提高和离体培养方法的改进，有可能最终消除或大大减少花培药养基因型的限制。 2.花药或小孢子培养体系做为基因转导的靶组织，可以实现稳定的转化，外源基因在后代中不易丢失或发生致命的突变，是很有前途的研究领域。,1999，美国洛克菲勒基金会的Toneeson在Science 撰文指出，现代生物技术育种的两大支柱是基因工程育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（DH育种），后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国情。,第四节 玉米组织培养,主要内容：,植

16、物组织培养的意义. 玉米组织培养的目的. 研究进展. 目前玉米组织培养的主要方法.,植物组织培养的意义,植物组织培养可以生产大量的优良无性系. 细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍. 可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体. 组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料.,玉米组织培养的目的,玉米组织培养的目的是让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效 的体细胞再生体系 ，为玉米遗传转化和细胞工程研究创造有利条件 。,玉米组织培养的研究回顾,Larue在 1949年用甜玉米的胚乳作外植体，首次诱出玉米愈伤组织，但未获得再生植株 。 1975年，Green和Phillips首次用A188的幼胚作外植体，诱导出二倍 体 愈伤组织 ，并再生得 到第一株无性系植株。,玉米组织培养的研究现状,现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组织，并再生出植株。例如：幼胚、花 药、幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前最常用的外植体。,玉米组织培养