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1、细菌的耐药性与控制策略,细菌感染威胁着人类的生存。1928年Flemming发现了青霉素,1941用于临床,细菌性疾病的治疗从此进入了抗生素时代。抗生素这一“神奇的药物”曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病,发病率和死亡率明显下降。然而进入20世纪80年代,细菌感染并不因为抗菌药物的广泛使用而减少,而是出现了更多的细菌感染;更令人担忧的是,越来越多的细菌产生了耐药性,甚至多重耐药性（multiple resistance),变得愈加难以对付,成为人类健康事业面临的严重问题之一。甚至还有的菌株对药物产生依赖性，既离开该抗生素则不能生长。,第一节 细菌的耐药性,耐药性（drug resist
2、ance）是指细菌对药物所具有的相对的抵抗力。耐药性的程度依该药对细菌的最小抑菌浓度（MIC）表示。 一细菌耐药性的分类 从遗传学的角度，细菌耐药性可分为： (一) 固有耐药(intrinsic resistance): 相传的天然耐药性 （二）获得性耐药(acquired resistance): 病原菌因各种不同原因对抗菌药物产生了抵抗力(即由原来敏感变为不敏感),致使疗效降低或治疗失败。多重耐药性：(multidrug resistance,MDR) 是指细菌同时对多种作用机制不同(或结构完全各异)的抗菌药物具有耐性。 交叉耐药性：(cross resistance) 是指细菌对某一种抗
3、菌药物产生耐药性后,对其他作用机制相似的抗菌药物也产生耐药性。,二 细菌耐药性的控制 1.基因突变导致的耐药性 由抗生素敏感基因突变为耐药性基因以单一耐药性为主。 2.R质粒决定的耐药性 特点：可从宿主菌检出R质粒；以多重耐药性常见；因质粒丢失成为敏感菌株,第二节 细菌耐药性产生的机理,细菌产生耐药性的过程也就是染色体或质粒上基因表达的过程。 一钝化酶的产生 耐药菌通过合成某种钝化酶作用于抗菌药物，使其失去抗菌活性。 （一） -内酰胺酶 （-lactamase) 对青霉素和头孢酶素类耐药的菌株产生该酶。（二）氨基糖苷类钝化酶（aminoglycoside modified enzymes),对
4、氨基糖苷类药物质粒介导的耐药机理是耐药性菌株产生磷酸转移酶，使该类抗生素，如氯霉素，卡那霉素等羟基磷酸化，而将抗菌药物钝化酶失活。 （三） 氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyl transerase) 由质粒编码的该酶使氯霉素乙酰化而失去活性。 （四） 甲基化酶 金黄色葡萄球菌携带的耐药性质粒编码产生一种甲基化酶 ，可使50S亚基中的23SrRNA上的嘌呤甲基化，而产生对红霉素的耐药性。,二 药物作用的靶部位发生改变 细菌通过产生诱导酶对抗生素的作用靶位 进行化学修饰,或通过基因突变造成靶位变异(alterationoftargetsite),使抗菌药物不能与靶位结合
5、或亲和力下降,失去杀菌作,但细菌的生理功能正常。 （一）核糖体 核糖体30S亚基S12蛋白发生构象变化,链霉素失去结合受体而不能发挥抑菌作用。肺炎链球菌能产生甲基化酶,使23SrRNA上的一个关 键性的腺瞟呤残基甲基化,使大环内醋类抗生 素与靶位即核糖体5OS亚基结合力下降而导致耐药。,（二）青霉素结合蛋白（PBP） -内酰胺类抗生素与其作用靶位PBP结合后，可干扰肽聚糖的正常合成,导致细菌死亡。但是,某些革兰阳性菌(如肺炎链球菌)和革兰阴性菌(如淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌)能改变其PBP的结构,使之与-内酰胺类亲和力降低而导致耐药。肺炎链球菌不产生-内酰胺酶,PBP发生改变在耐药性形成上具有非
6、常重要的作用。,（三）二氢叶酸代谢酶 甲氧苄啶(TMP)通过抑制二氢叶酸还原酶(Mr21000)而杀菌,但耐药菌能产生大量的功能相同的新蛋白(Mr21000)，不被TMP抑制。细菌改变二氢叶酸合成酶构型,与磺胶药的亲和力下降100倍,敏感菌转为耐药菌。,三 药物积累不足 (一) 减少药物吸收(reduced drug uptake) 由于细胞壁的有效屏障或细胞膜通透性的改变,阻止药物吸收,使抗生素无法进入菌体内发挥作用。例如,分枝杆菌的细胞壁存在异常紧密的结构,通透性极低;铜绿假单胞菌外膜上由孔蛋白构成的蛋白通道较特殊,通透能力比大肠埃希菌低100多倍,加之生物膜(biofilm)的形成而使抗
7、菌药物不易进入菌体,故结核分校杆菌和铜绿假单胞菌对众多的抗菌药物呈现明显的天然耐药性。,革兰阴性菌具有选择性低通透性的外膜屏障,微孔蛋白通道对一些抗菌药物的进人具有阻碍作用,故对许多抗菌药物产生耐药性;而革兰阳性菌无外膜屏障,对许多疏水性抗生素(如-内酰胺类)更为敏感。在接触抗生素后,细菌可改变外膜蛋白的组成或减少其数量(如OmpF和OmpC的表达减少),降低外膜通透性,产生获得性耐药,如鼠伤寒沙门菌对多种抗生素耐药,即为其缺乏蛋白通道。亚胺培南通过通道OprD2扩散,铜绿假单胞菌因缺乏OPE-D2而呈耐药。,（二）增加药物排出(enhanced drug effIux) 细菌产生多重耐药性的
8、主要原因是,具有能量依赖性的主动外排系统,可将不同结构的抗生素(如氯霉素、大环内酯类、氟喹诺酮类、内酰胺类等)同时泵出体外,使菌体内的抗生素浓度明显降低,不足以杀死细菌。细菌还具有仅排出一种或一类抗菌药物的“单”耐药系统,如最早发现的大肠埃希菌四环素主动外排泵,能通过质膜蛋白TetA利用跨膜氢离子梯度,即质子驱动力（proton motive force,PMF)作为能量,将累积到一定浓度的四环素泵出胞外,阻止它作用于靶位核糖体。,据组成和外排机制,主动外排系统可分为主要易化家族、肿瘤耐药性调节分化家族、萄球菌多重耐药家族和ATP结合转运器;按能量依赖形式,分为:具有2个跨膜单位和2个ATP结
9、合单位,利用ATP-Na+-K+泵作动力;单跨膜单位,利用质子泵作动力进行反向转运。 主动外排系统通常由外排转运蛋白、外膜通道蛋白和连接蛋白(或辅助蛋白)三部分成。例如,铜绿假单胞菌MexAB-OprWI外排系统包括:MexB:具有主动转运功能,镶嵌在细胞膜;OPrM:位于细胞外膜,具有孔蛋白的作用; MexA:为辅助蛋白,存在于外膜和膜之间,起连接MexB和OprM的作用。,内酰胺类经外膜孔蛋白进入周浆间隙，结合细胞膜外侧，被MexB捕获，借助MexA辅助蛋白桥联作用，经OprM排出菌体。非内酰胺类抗生素经外膜孔蛋白进入周浆间隙后，通过扩散等过程穿过细胞膜进入菌体，MexB可在细胞膜内侧捕获
10、这些抗生素,经过MexA和OprM协同作用排到细胞外。 MexAB-OprM等主动外排系统与外膜通透性降低的协同作用,使得铜绿假单胞菌对多种类型的抗菌药物耐药。 具有抗菌药物主动外排系统的病原菌主要是:大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、流感杆菌、空肠弯曲菌、金葡菌和结核杆菌等。但伤寒杆菌、志贺菌未见主动外排系统,可能是这两种菌耐药性上升较慢的原因。目前未发现能够泵出氨基糖苷类抗生素的主动外排系统,可能与其独特的化学结构有关。,四、 抗菌药物的使用与细菌耐药性的关系 耐药菌株出现和扩散的因素繁多,但起关键作用的是:耐药基因发生突变使耐药谱增大;细菌间遗传物质交换,将耐药基因转移到新宿主;医院及社区抗
11、生素的广泛应用,为耐药菌产生和存在于体内,或更为广泛地扩散,以及引起疾病提供了重要的选择压力(selective pressure)。前两个为细菌本身生物特性因素,是耐药性产生的客观依据,后一个是人为因素,是抗生素耐药性迅速传播的主要推动力。此外,还与感染控制措施应用不当,各种先进的侵袭性诊治手段广泛应用,以及免疫忍容性宿主(immuno-comproised host)增多等因素有关。,（一）抗生素的诱导作用 AmpC-内酰胺酶基因表达的诱导AmpC-内酰胺酶具有很强的可诱导性。通常情况下,AmpC酶不表达或低水平表达,但在-内酰胺类抗生素存在时,该酶产量显著上升,如阴沟肠杆菌AmpC酶活性
12、比诱导前提高100倍左右,甚至1000倍,达到完全去抑制型水平。通常在强诱导剂(特别是亚胶培南、头孢西丁)诱导后,AmpC酶的活性可以灭活第一、二、三代头孢菌素和单环内酰胺类。 位于细胞膜上的AmpG将正常代谢中细胞壁降解物（UDP-N-乙酸葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽）从周浆间隙转运到细胞内,胞内AmpD能水解细胞壁降解物(包括UDP-N-乙酸葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽， UDP-N -乙酰胞壁酰三肽）释放糖和小肤(L-Ala -D -Glu-DAP),重新参与细胞壁合成的再循环。,当-内酰胺类抗生素不存在时,AmpR为负调控因子(抑制子),主要与一个抑制性配体-细胞壁前体UDP-N-乙酰胞壁
13、酰五肽结合,以失活状态结合在ampR-ampC之间区域,使ampC基因的转录处于受抑制状态。但当-内酰胺类抗生素存在时,细胞壁合成受阻,细胞壁降解产物UDP-N-乙酰胞壁酰三肽水平升高,UDP-N-乙胞壁酰五肽水平降低,N-乙酰胞壁酰三肽与抑制性配体竞争AmpR上的结合位点,从而解除抑制性配体的抑制作用。此时,AmpR为正调控因子(激活子)。AmpR激活ampC基因的转录,过量表达AmpC酶。 AmpD维持UDP-N-乙酰胞壁酰五肽与UDP-N-乙酰胞壁酰三肽在数量上的平衡,控制着ampC转录信号的强弱。AmpD基因突变产生有功能缺陷的AmpD时,AmpR即以激活子状态发挥作用,引起大量的-内
14、酰胺酶表达,成为稳定去抑制表型。在使用某些第三代头孢菌素期间,可诱导选择出稳定的去抑制的突变株,使AmpC酶高水平表达。,二、抗生素的筛选作用 通过自发突变或“耐药基因”转移而成为耐药性的菌株,具备了适应外界环境改变的能力,但是,耐药菌 株在菌群中仅占极少部分,并且需消耗能量保持耐药基因或泵出抗菌药物,外膜通透性降低虽能阻止抗生素进入,但亦影响营养物质的吸收,因此,在自然环境 下,耐药菌难以与占有压倒优势的敏感菌竞争,其生 长规模必然受到正常菌群的拮抗。然而,抗生素的广泛应用提供了对耐药突变株的选择环境. 研究发现,许多很少服用抗生素的病人刚住院时,其肠道及其他部位分离的菌株大部分是敏感菌株。
15、当给病人长期使用抗生素,尤其是广谱抗生素时,敏 感菌株将迅速被抑制或淘汰,使得病人对医院流行的耐药菌株变得更加易感,耐药性细菌乘机侵入并大量繁殖,成为新的优势菌,最终取代敏感菌株的地位。,抗生素的筛选作用从总体上导致耐药基因库扩充,病原菌获得耐药性机会增加,一些耐药菌本身也可成为条件致病菌。例如,万古霉素投入临床使用30多年后,一直没有出现明显耐药现象。随着MRSA、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌和艰难梭菌感染暴发流行,万古霉素用量急剧上升,20世纪80年代出现VRE,并迅速波及全球,粪肠球 菌已成为万古霉素耐药性贮存宿主,进而可能传播到金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。又如,粪肠球菌对头孢菌素呈现固
16、有耐药,头孢广泛应用促进粪肠球菌大量繁殖,已成为医院感染重要病原菌。,（三）抗生素在临床和临床之外的应用 1 临床方面的应用 细菌耐药性的产生、变迁与临床上抗生素广泛或过度应用有绝对关系。医院环境中抗生素选择压力的长期存在,一方面筛选出毒力弱,但对许多抗生素呈固有耐药的条件致病菌;另一方面筛选出毒力强,原来对抗生素敏感转呈耐药的致病菌。 医院是抗生素使用集中的地方,院内的细菌耐药率明显高于社区,同一种细菌,院内分离株耐药性较强和较广谱。对某一特定药物耐药率的波动与医院抗生素使用规定的变化有关。 在ICU耐药菌检出率远高于其他病房，一些原本无致病性的前几年未曾听说的细菌，因抗生素的滥用出现多重耐药性已成为住院病人致命的血源性感染重要病原菌。,那么,人类是如何陷入细菌耐药性的困境呢?调查发现,在绝大多数病历,在病原菌及其药敏结果出来前已开始凭经验
