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1、聚合酶链反应及其应用,检验医学院 周 兰 ,分子诊断学,重医医学学士（1979年，临床医学） 重医医学硕士（1986年，病理生理学） 重医医学博士（1994年，临床检验诊断学） 芝加哥大学博后（00-03年，分子肿瘤实验室） 电子邮箱 ,检验医学院 周 兰,本讲内容,1 PCR概述 2 PCR原理 3 PCR产物检测与分析方法 4 PCR特点及应用 5 PCR技术发展简史 6 PCR衍生技术 7 荧光定量PCR 8 其它基因扩增检验技术 9 PCR相关检验的质量管理,1-1 基因扩增及其方式 gene amplification gene magnification,1 PCR（Polymer
2、ase chain reaction）概述,1-1 基因扩增,1）定义：指基因拷贝数增加的现象 是基因表达增加的一种重要机制 一般说来 正常细胞中，特定基因的扩增与其对内外环境因素的应激反应有关 病变细胞中，基因扩增则是致病因素所致的异常扩增,如肿瘤细胞中常见癌基因的扩增 2）方式？,2） 基因扩增的方式,（1）天然扩增-机体细胞内的扩增 在各种因素（发育和进化的需要、对环境刺激的应答等）作用下，机体细胞内相关基因的复制扩增 （2）人为扩增 分子克隆-体外、细胞内 DNA合成仪-试管内（无细胞体系） PCR-试管内（无细胞体系）,重组DNA,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取目
3、的DNA分子,1）基础研究的需要 *医学生命科学研究 *农林畜牧鱼业的基础研究 2）应用研究及应用的需要 *医学领域（如基因诊断、法医学检测） *现代生物技术产业（药物开发，疫苗， 高质量食品和日常生活用品等） ,1-2 PCR技术诞生所依赖的社会需求,1-3 PCR的定义,模板DNA 引物（引子序列，一对） 耐热DNA聚合酶 四种单核苷酸 Mg 2+,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,DNA引物,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,DNA引
4、物,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,一个分子DNA变成两个分子,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,两分子DNA变成4分子DNA,利用DNA聚合酶催化一对引物间的特定DNA片段在体外实现快速、大量扩增的方法 也称：无细胞克隆技术 或：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法 是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新,1-3 PCR定义,现已广泛应用到分子生物学
5、研究、临床检测等各个领域。 优点： 特异、敏感、简便 自动化 快速、高效（数小时内可使模板扩增107108倍）,2-1 DNA的变性和复性 2-2 PCR标准反应体系及反应过程-三步曲 2-3 反应的结果 2-4 PCR的反应条件及其对PCR的影响 2-5 产物片段及其累积过程,2 PCR原理,2-1 DNA的变性与复性,DNA的变性（denaturation) 热变性是实验室最常用的方法 DNA的复性（renaturation),1）标准反应体系（五要素） （1）DNA模板(template)：靶基因 （2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） （3）催化酶：耐高温的D
6、NA聚合酶（如：Taq酶） （4） 一对引物（primer）：扩增序列的决定者 其与靶基因两侧序列互补 （5） Mg2+ 和 Buffer,2-2 PCR标准反应体系及反应过程,高温变性：在高温（95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板 低温退火：在低温（3755）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链 适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72）下，以引物的3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链,2） 反应过程-三步曲,2）PCR的反应过程,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,
7、DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR原理示意图,Sample denaturatation Primer annealing Primer extension,2-2 反应过程,播放PCR短片,1）每一条双链DNA模板，在一次热循环后就成了 两条双链DNA分子 2）每次循环产生的DNA均能成为下次循环的模板 3）每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物以指数形式（2n）迅速扩增 4）经过2530个循环后， 理论上可使基因扩增109倍以上 实际上一般可达106107倍（ why？）,2-3 PCR的结果,式
8、中：Y 表示扩增产物的量 A 表示n-1次扩增时DNA分子数量 E 表示扩增效率 n 表示循环次数 扩增30个循环，即n=30时 若E=100%，则y=230=1073741824(109) 若E=80%，则y=1.830=45517159.6(107) 由此可见，其扩增的倍数是巨大的!,PCR反应动力学公式：Y=A（1+ E）n,2-3 PCR的结果 30次循环后靶序列扩增的数量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Ampl
9、icon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭（EB)等染色，在紫外灯照射下可见到DNA的特异扩增区带,是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出红色荧光 根据情况，可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB；有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min EB染色后，肉眼可见核酸电泳带的DNA量一
10、般5ng 它是一种高诱变性的化学物质 SYBR-green 和 gelred 是毒性更小的染料,溴化乙锭(ethidium bromide，EB),2-4 PCR的反应条件及其对PCR的影响,PCR操作程序 向一微量离心管中依次加入双蒸水、缓冲液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶 混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底 加矿物油50100l于反应液表面，防蒸发 置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环,PCR反应五要素 引物（primer） 酶（Taq DNA polymerase） dNTPs （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板（template）
11、Mg2+ （magnesium）,1）模板：* 单、双链均可 *几乎不需要纯化 *但，必须了解靶基因两侧的核酸序列 *一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞或裂解病原体，再消化除去染色体的蛋白质以游离靶基因，便可直接用于PCR扩增 * RNA模板提取时，要防止RNase降解RNA 注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类, 微生物 细胞：血痕、精斑、口腔拭子、阴道拭子、尿样、单根毛发、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆虫、木乃伊 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.12ug/100ul体系 *PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著
12、升高 *但，模板DNA浓度过高，则致非特异性产物增加,模板DNA的来源,2）耐热的DNA聚合酶,来自嗜热水生菌，耐热 具有 5-3方向的聚合酶活性 5-3外切酶活性 逆转录酶活性 酶量增加：降低反应的特异性 酶量过少：降低反应的产量 来源： 有提纯产物 也有基因工程产品,例：经典的Taq DNA聚合酶的特性,该基因2496bp（832aa），酶蛋白为94KDa 酶催化反应速度与温度的关系 7580：延伸约150nt/酶分子/s 70: 延伸60nt/酶分子/s 55: 延伸24nt/酶分子/s 温度过高(90以上) 过低(22以下),都降低Taq DNA酶活性,良好的热稳定性： PCR混合物中
13、的Taq DNA聚合酶 92.5 X 130min 95 X 40min 97.5 X 56min 其热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件 也是PCR技术能迅速发展和广泛应用的重要基础,仍可保持50%的活性,例：经典的Taq DNA聚合酶的特性,忠实性 该酶无35外切活性 SO,在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶无法予以校正 即其保真性不如Pfu DNA聚合酶等 其碱基错配机率：2.110-4,例：经典的Taq DNA聚合酶的特性,离子依赖性 Taq 酶依赖Mg2+，对Mg2+非常敏感 *以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2
14、+进行PCR反应10min，发现：MgCl2在2.0mmol/L时TaqDNA聚合酶的活性最高 *Mg2+过高：抑制酶活性 Mg2+在10mmol/L时可抑制4050%的酶活性,例：经典的Taq DNA聚合酶的特性,TaqDNA聚合酶,具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链的3端加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3突出的单A核苷酸尾 另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3端加入单T核苷酸尾，产生3端突出的单T核苷酸尾 应用该特性，可实现PCR产物的T-A克隆法,除经典的Taq酶外，还陆续发现下列耐热酶 1）Tth DNA聚合酶： *从Thermus thermoph
15、ilus HB8中提取而得 *该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA *当再加入Mg 2+后，该酶的聚合活性大大增加 SO，逆转录为cDNA与DNA的扩增可用同一种酶催化 即该酶适用于RT-PCR,2）pfu DNA 聚合酶,是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低，催化DNA的忠实性比Taq DNA聚合酶 高12倍 PCR产物为平端（无3端突出的单A核苷酸）,3）Vent DNA聚合酶 *是从Litoralis栖热球菌中分离出的 *不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能 *可扩增 12kb的模板DNA,对PCR所用的聚合酶的选择原则和参考信息 （自学，了解）,TaKaRa PCR Enzymes,1.TaKaRa TaqTM 1） 用于12 kbp以下的DNA片段的PCR扩增 2） 比较经济的PCR用DNA聚合酶 3） 适用于一般的PCR扩增或检测 2.TaKaRa Ex TaqTM 1） 用于15 kbp以下的DNA片段的PCR扩增 2）融合了LA- PCR技术
