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1、基 因 工 程 原 理 Principles of Genetic Engineering,山东理工大学生命科学学院,基因工程原理,目的基因,基因载体,重组子,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,1.重组率,重组子（目的重组子） 自我连接载体（非重组子） 两个相互连接的载体以及两个基因片段插入的载体（非目的重组子）,2. 转化率 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 重组子中存在非目的重组子。,转化子,重组子,目的重组子,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,重组子的筛选与鉴定,山东理工大学
2、生命科学学院 张建勇,基因工程原理,“选择”（selection）和“筛选”（screening）的基本含义,选择，是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接选择。 筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。,第七章 重组子的筛选与鉴定,一、 遗传检测法 二、 物理检测法 三、 杂交检测法 四、 免疫化学检测法,确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。,一、 遗传检测法,1根据载体表型特征选择重组
3、体分子 2根据插入序列表型特征选择重组体分子,1根据载体表型特征选择重组体分子,载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。 (1) 抗生素抗性基因插入失活选择法 (2) -半乳糖苷酶显色反应选择法,(1)抗生素抗性基因插入失活选择,检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活效应(insertional inactivation)。 适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。 四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗
4、性基因(ampr) 等,pBR322,特点： 多种抗药标记 分子量低：4363bp 高拷贝 多单酶切位点 不影响复制,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,pBR322抗菌素标记选择,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环
5、素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,1.PBR322含Ampr和tetr，具有Ampr和tetr表型。 2.在tetr任何一个酶切点插入外源基因片断，都会导致tetr失活。 3.转化插入外源基因的PBR322的菌液涂布于含Amp的平板上，存活者必定是转化子。（Ampr） 4.将存活菌复印在含tet的琼脂板上，对照2个平板，凡在Amp平板上生长而在tet平板上不生长的菌落，必定是带有外源基因的重组子。,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,更小的分子量和更高的拷贝数
6、 -半乳糖苷酶显色反应检测重组体 具有多克隆位点,2686bp,(2) -半乳糖苷酶显色反应选择法,区分转化子与非转化子,(2) -半乳糖苷酶显色反应选择法,将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌落呈现出蓝色。 外源DNA插入到它的lac Z基因上所造成的-半乳糖苷酶失活效应，大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜色为白色。,-半乳糖苷酶法,-半乳糖苷酶显色反应选择法,
7、-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码（不破坏肽）。,选择过程,白色菌落 （重组子）,蓝色菌落 （非重组子）,蓝色菌落 （非重组子）,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,（3）溶菌选择法,DNA感染E.coli发生溶菌生长，形成很亮的噬菌斑，溶源生
8、长多少也有溶菌，挑选噬菌斑即可分析鉴定转化子。,2根据插入序列的表型特征选择重组体分子,基本原理：转化的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。 例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,弥
9、补缺陷,常见的营养缺陷型筛选标记： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,增加新性状,二 物理检测法,凝胶电泳检测法 限制酶切检测法 R-环检测法,1.凝胶电泳检测法,重组体在相对分子质量上会有所增加。分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。通常用比较简单的凝胶电泳进行检
10、测。 电泳法筛选比抗药性插入失活平板筛选更进了一步。有些假阳性转化菌落，如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个相互连接的载体以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落，用平板筛选法不能鉴别，但可以被电泳法淘汰。,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,DNA电泳检测法,分子量 Marker,载体,重组克隆,如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，对于这样的阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有用Southern blotting杂交，即以目的基因片段制备放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳
11、性重组体。,（3）PCR扩增检测法,原理：,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,过程：,从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,用外源DNA插入片断引物作PCR。,电泳PCR产物。,检查是否有PCR产物。,PCR产物的长度是否与外源基因一致。,菌液PCR,用EP管离心收集少许菌体（菌体的量无需太多），加入适量的灭菌水重悬，沸水10min，12000rpm离心5min，用上清做模板进行PCR。 94度变形可以裂解细菌，释放出DNA，所以不用提质粒也可以PCR出来条带。 菌液PCR假阳性率高，建议在做过菌液PCR后，选取阳性菌株提取质粒PCR、酶切。,2.限制酶切分析法,限制性酶切图谱法就是对
12、载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法能区分重组子与非重组子，还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,酶切鉴定是必需的 1.限制性图谱个体特异性, 不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 2.同一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。 3.插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切 可鉴定载体及 插入片段的大小，方向，切后并电泳分析，以确定是否得到预期的重组DNA。 若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可
13、进行序列测定。 若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。,EcoRI,PBR325-APOAI,PUC19-APOAI,加样孔,2.7kb,5.4kb,0.89kb,PUC19-APCAI和PBR325-APOAI质粒PNA及其ECORI酶切产物的琼脂糖电泳图,PUC19,质粒小量快速提取加酶切鉴定,本法适用于: 单酶单切点 双酶双切点 重组DNA转化菌落明显多于(理论应该多)载体对照组时首选。 基本流程是: 挑选平板转化菌落小量培养快速提取质粒。 酶切DNA和载体对照电泳即可判断所选菌落是否含有重组DNA分子。,筛选过程,3.R-环检测法,临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中
14、，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA及DNA的，RNA便会同双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而另一链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构。 R-环结构十分稳定，可以在电子显微镜下观察到。可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。,三 核酸杂交法,带有互补序列的DNA或RNA，其相应的同源区段就会退火形成双链结构；如果退火的核酸来自不同的有机体，形成的双链分子就被称为“杂种核酸分子” DNA/DNA杂交揭示亲缘关系的远近。 DNA/RNA杂交也可用来揭示核
15、酸片段中特定基因的位置。,核酸杂交通常采用一种带上放射性同位素或荧光标记的纯的单链DNA或RNA作为探针（probe），从一个大的未知的DNA或RNA群体中筛选到与之互补的同源DNA或RNA序列。 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。,核酸探针的来源：,目的基因的部分已克隆序列 与目的基因同源性很高的已克隆的其它基因 寡核苷酸探针,（一）、核酸杂交流程,通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转
16、移到滤膜的过程中继续保持着。 烘烤或紫外交联法固定DNA片段 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置。 X光底片曝光，得到放射自显影图片,荧光标记法,（二）、杂交方法,原位杂交 斑点杂交 Southern 印迹杂交 （Southern blotting ） Northern 印迹杂交（Northern blotting ） Western 印迹杂交（Western blotting ）,1.原位杂交,原位杂交(insitu hybridization)亦称菌落杂交或噬菌体杂交。这是因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。 这种方法对于从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑具有特殊的实用价值。,2.斑点杂交,斑点杂交（Dot blot）：是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，一张膜上可同时检测多个
