{设备管理}发酵设备的异常和染菌培训讲义

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1、发酵设备的异常和染菌,第十章,一、生物制药过程灭菌的重要性,大多数工业发酵都要保持纯种培养，这就需要有一套能够适用于工业生产的灭菌技术和防止染菌的技术。,生物制药过程染菌的危害： 许多工业发酵过程染菌后均能影响其生产经济效益，尤其是抗生素发酵中的染菌，能够严重地威胁抗生素的生产，是抗生素工业的致命伤。 工业发酵中的染菌不仅可造成巨大的经济损失，而且还会扰乱生产秩序、破坏生产计划，遇到连续染菌，特别是在找不到污染原因而缺乏防止措施时，往往会影响人们的情绪和生产积极性。,一、生物制药过程灭菌的重要性,发酵染菌还会影响后道工序的正常生产、影响产品外观及内在质量、增加三废处理难度，进而影响环境保护等造

2、成无法估量的危害。,二、染菌控制的发展历史,近半个世纪以来，随着抗生素工业发酵技术的不断发展，逐渐形成了一整套保持纯种培养的灭菌和染菌防治技术。 国内很多发酵工厂，特别是抗生素生产工厂，由于掌握了灭菌和制服发酵染菌的技术，使发酵染菌率达到了比较先进的水平。 根据这些工厂的成功经验，其关键是在染菌的表象中，寻找造成染菌的错综复杂的原因，进而不断地提出解决和防治的措施，使发酵染菌率不断降低。,二、染菌控制的发展历史,尽管造成工业微生物发酵染菌的原因错综复杂，但大多数原因通过仔细观察和认真分析，是可以找到的，而且也有相应的有力措施。,第一节,灭菌的理论和技术,灭菌：是指用化学的或是物理的方法杀灭或去

3、除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。 消毒：仅是指用化学的或是物理的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。,用于工业规模和一般实验室规模的灭菌方法主要有: 热灭菌（包括湿热灭菌和干热灭菌) 化学药剂灭菌 射线灭菌 介质过滤除菌等,一、热灭菌的原理和方法,1干热灭菌的原理和方法 干热灭菌的主要作用： 干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等从而使微生物细胞中毒死亡。 其中导致微生物死亡的主要作用是氧化。在干热处理中，只要有足够高的温度和足够长的时间，所有微生物都可被杀灭。,一般采用的干热灭菌的条件: 160 、120 min。,一、热灭菌的原

4、理和方法,干热灭菌的效果不如湿热灭菌： 微生物对干热的耐受力要比对湿热的耐受力强得多。这可用温度系数Q10来表征。 Q10是指：温度升高10时微生物的死亡速度常数与原来温度时的死亡速度常数的比值。,一、热灭菌的原理和方法,一、热灭菌的原理和方法,表中列出了一些微生物菌种的Q10。从表中的内容可知，干热灭菌时嗜热脂肪芽孢杆菌的Q10仅为2.86，而在湿热灭菌时的Q10却高达14.28。,某些微生物的Q10,干热灭菌的适用范围： 适用于工业上要求的灭菌后仍能保持干燥状态的物料的灭菌。实验室规模的玻璃器皿等器具常采用干热灭菌。 干热灭菌的温度和时间的关系可参考下表。,一、热灭菌的原理和方法,干热灭菌

5、的温度和时间,2湿热灭菌的原理和方法 湿热灭菌的原理： 借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键遭到破坏而引起不可逆的变性导致微生物死亡。 下表列出了卵蛋白中水分的含量与其凝固温度的关系。,一、热灭菌的原理和方法,蛋白质水分含量和凝固温度,湿热灭菌中水分的作用： 1.由于水分子的存在，使蛋白质更易因受热而凝固变性。 2.在高温下水还能直接与复杂的生化成分反应，破坏必需的细胞成分或者产生有毒的副产物。,一、热灭菌的原理和方法,一、热灭菌的原理和方法,湿热灭菌中水分的作用： 3.在灭菌过程中水有助于杀死微生物的第二条途径是通过增加热导系数。犹如人能将其手快速

6、地穿过800的蜡烛火焰而不会感到灼热或疼痛，而穿过100的茶壶喷出的蒸汽流时，手指会受伤。,方法： 利用蒸汽进行湿热灭菌时，可通过调节蒸汽的压强来调节灭菌温度。但应注意的是，有时压力计指示的压力并不总是表示相应的温度。因此，在采用湿热灭菌时，应注意以下两个因素：,一、热灭菌的原理和方法,(1)压力计的选用 压力计选用包括选定压力计的型式及决定压力计的量程两个方面。弹簧管压力计是测量蒸汽压力而被广泛使用的压力计。在被测压力比较平稳的情况下，规定被测压力的最大值是选用压力计满刻度的34。如被测压力是脉动的，则规定被测压力的最大值是选用的压力计满刻度的2/3。,一、热灭菌的原理和方法,被测压力的低限

7、，在以上两种情况下都不应该低于所选压力满刻度的13，以保证读数误差不致太大。选用满刻度或太小的压力计，都不能得到准确的读数。,一、热灭菌的原理和方法,(2)压力容器中残留空气的排放 压力容器中有空气存在时，空气与蒸汽混合，蒸汽分压与空气分压之和为容器的总压力。蒸汽分压低于无空气残留时的蒸汽压力时，则蒸汽冷凝温度降低，不能起到完全灭菌的作用。残留空气愈多，温度则愈低。,一、热灭菌的原理和方法,判断压力容器中的空气是否排除干净的判断方法： 可根据排气口排出气体的温度来判断。若排气温度已达到100，则表明空气已排除干净。 容器上的压力计和温度计的安装位置须能正确指示容器内的压力和温度。压力计应安装在

8、远离蒸汽进口的上方，温度计则安装在近空气出口处。,一、热灭菌的原理和方法,3培养基及有关设备的灭菌方法 培养基灭菌过程中，除了微生物被杀死外，还伴随着培养基成分的破坏。在蒸汽加压加热情况下，氨基酸和维生素等都易被破坏。在工业生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏量减少到最小的条件。,一、热灭菌的原理和方法,根据微生物对数残留定律(灭菌过程中，在一定温度下残留微生物的数量随时间增加而以对数速率减少)，灭菌过程中培养基受热破坏呈化学反应的一级动力学反应。生产实践证明，灭菌温度较高而时间较短的灭菌效果要比灭菌温度较低而时间较长的好。,一、热灭菌的原理和方法,(1)实罐灭菌(分批灭菌) 先

9、将输料管路内的污水放尽并冲洗干净，再特配制好的培养基用泵打到发酵耀、种子耀或补料罐内(较小体积的配料可直接在罐内配制)，然后开动搅拌器进行灭菌。其操作过程大致可分为：,一、热灭菌的原理和方法,培养基预热 灭菌时培养基需先加热到80-90，然后再导入蒸气升温到120-180。 预热的目的： 一是若直接导入蒸汽，由于培养基与蒸汽的温差过大会产生大量的冷凝水使培养基稀释。 二是若直接导入蒸汽容易造成泡抹急剧上升而引起物料外溢。,一、热灭菌的原理和方法,一、热灭菌的原理和方法,培养基预热 预热的方法：先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升到8090，将排气阀逐渐关小。,培养基灭菌 将

10、蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内(如有冲视镜管则也同时导入蒸气)，使罐温上升到120130，罐压维持在105Pa(表压)左右，并保温30min。,一、热灭菌的原理和方法,灭菌时应注意： 各路蒸气进口的进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度； 排气量不宜过大，以节约蒸气用量； 灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而抽吸外界空气； 在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基(或物料)将倒流入过滤器内，灭菌时总蒸气压力不低于33.5 105 Pa(表压)，使用压力不低于2 10

11、5Pa(表压)。,一、热灭菌的原理和方法,(9)连续灭菌 培养基通过连续灭菌以比分批灭菌高的温度和较短的时间，进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酸罐中。,一、热灭菌的原理和方法,一、热灭菌的原理和方法,培养基预热 将料液预热到60-75，避免连续灭菌 时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水气撞击声。,一、热灭菌的原理和方法,连续灭菌 连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸气与料液迅速接触混合，并使料液温度很快升高到灭菌温度。 连续灭菌的温度一般以126132为宜。由于输送培养基的连消泵的出口压力一般为6105Pa，所以总蒸汽压力要求达到4.55.0

12、105Pa以上。只有当两者压力接近，培养基流速才能均匀稳定，否则流速非快即慢，影响灭菌质量。,一、热灭菌的原理和方法,维持灭菌温度 由于连消塔加热时间较短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保持67min，以达到灭菌的目的。维持罐的罐压一般维持在 4105Pa左右。,一、热灭菌的原理和方法,冷却 生产上一般采用冷水喷淋冷却，即用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷却到40-50后，输送到预先空消过的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内应充满填料。,一、热灭菌的原理和方法,连续灭菌的特点： 连续灭菌的温度较高，时间较短，培养基受到的破坏较少，故质量较好。

13、连续灭菌时由于培养基灭菌不在发酵罐内进行，所以发酵罐的利用率较高，此外，连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。 但连续灭菌的不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。,一、热灭菌的原理和方法,(8)空罐灭菌 空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。 空罐灭菌一般维持罐压1.52.0105Pa，罐温125130，时间3045min。 灭菌时要求总蒸气压力不低于3.03.5105Pa，使用压力不低于2.53.0105Pa。 灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。,一、热灭菌的原理和方法,(4)发酵附属设备及管路的灭菌 发酵附属设备：总空气过滤器、

14、管道、计量罐、补料罐等。 一般糖水罐灭菌时罐压为1105Pa、时间为30min。灭菌时要使糖水翻腾良好，温度不宜过高，否则糖料易炭化。 油罐(消沫剂)的罐压为1518105Pa、时间为60 min。,一、热灭菌的原理和方法,一、热灭菌的原理和方法,(4)发酵附属设备及管路的灭菌 总空气过滤器灭菌时，先关闭总进气和出气阀门，开启放气阀门，使总空气过滤器内的压力降到零(表压)。 总空气过滤器灭菌的蒸汽压力为36105Pa左右，蒸汽自上端输入，上下放气口放气，总过滤器内压控制为152.0105Pa(表压)，灭菌时间2h。灭菌完毕，自上端输入空气，自上而下吹干过滤介质。,(5)影响加热灭菌的因素 影响

15、加热灭菌的因素很多，其中包括：水分、脂肪、盐类、糖、pH值、蛋白质、菌含量、培养温度、不同的微生物生长阶段、灭菌的温度与时间等。 因此，在具体加热灭菌时应考虑上述这些影响因素，适当地调整灭菌条件。在上述这些影响因素中，灭菌的温度与时间是最为重要的因素。表11-7一1110列出了这些关系。,一、热灭菌的原理和方法,化学药剂灭菌的原理：与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。 作为灭菌用的化学药剂必须具备以下四个条件： (1)杀菌谱广且有效浓度低和杀灭微生物的速度快； (2)性质稳定，易溶于水且可在常温下使用； (3)基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素的影响； (

16、4)无腐蚀性、无毒或低毒、使用安全。,二、化学药剂灭菌的原理和方法,常用的化学药剂包括： 甲醛、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉、过氧乙酸、乙醇和新洁尔灭等。 其用途和使用方法见表11-11。,二、化学药剂灭菌的原理和方法,二、化学药剂灭菌的原理和方法,三、射线灭菌的原理和方法,射线灭菌即利用紫外线、高能量的电磁波或粒子幅射灭菌。,三、射线灭菌的原理和方法,紫外线的灭菌功能： 低压水银电弧发射的紫外线，对微生物有杀灭作用。其波长在2100-3132范围内有效，而最常用的有效波长为2537。 紫外线对芽饱和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，只能用于表面灭菌，它对真菌孢子的杀灭能力不大。,紫外线灭菌的适用范围： 在发酵生产和实验室规模，紫外线主要用来进行一定空间内空气的灭菌(如无菌室等），而用于大量空气的灭菌，技术上有许多困难，因此在工业生产中用紫外线对杀灭大量流动空气中的细菌意义不大。 紫外灯的使用寿命：商品紫外灯输出波长2637的紫外线达95，长期使用后能量逐渐衰减，杀菌效果亦即降低，因此需定期更换。,三、射线灭菌的