生物制品鉴定资料讲解

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1、第八章 生物制品鉴定,一、掌握消毒、灭菌、滤过除菌、无菌试验 及热原质试验的概念。 二、掌握生物制品常用的防腐剂。 三、掌握无菌试验抽样的原则；熟悉无菌试 验方法；了解无菌试验用培养基。 四、掌握生物制品热原质实验合格标准。,【目的要求】,第一节 消毒灭菌与滤过除菌,消毒杀死物体上的致病性微生物， 但不 一定杀死全部微生物。 灭菌将物体上所有的微生物，包括致病的和 非致病的，以及细菌的芽胞在内，全部杀死。,一、消毒灭菌的基本概念,（一）定义,4,防腐: 防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。,防腐剂用以抑制细菌生长繁殖的物质。,杀菌剂用以杀死细菌的物质称为杀菌剂。漂白粉、亚硫酸盐等,无菌: 不含活

2、菌。防止细菌进入机体或物品 的技术，称无菌操作。,（一）物理消毒灭菌法,1、热力消毒灭菌法（干热、湿热）,2、辐射杀菌法（紫外线、电离幅射、微波）3、滤过除菌法（除菌滤器、适用物品）4、超声波（机制：裂解细菌，主要用于粉碎细 胞、提取抗原）5、低温抑菌,7,（一）物理消毒灭菌法,1、热力消毒灭菌法,高温杀灭细菌,干热灭菌法,焚烧 最彻底的灭菌方法烧灼 直接用火焰灭菌方法干烤 加热 160-180； 2 h红外线 热效应 与干烤类似,（一）物理消毒灭菌法,热力消毒灭菌法,湿热灭菌法,巴氏消毒法 较低的温度61 30min/71 15-30s 杀灭致病菌繁殖体 煮沸消毒法 100 5 mim(繁殖

3、体 )；2h(芽胞 ) 流动蒸汽消毒法 水蒸气100 15-30 mim(繁殖体 ) 高压蒸汽灭菌法 最有效的灭菌方法 121 20-30mim,9,10,湿热灭菌与干热灭菌效果比较,同一温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好,1、湿热中细菌菌体蛋白较易凝固。2、湿热的穿透力比干热大。3、湿热的蒸汽有潜热。,11,2、辐射灭菌法,日光：污染的衣物、被单等 紫外线：不耐热物品的表面 消毒 手术室、传染病房、细菌实验室 电离辐射：一次性医用塑料制品的 消毒、食品的消毒,12,3、滤过除菌法,定义： 许多可溶性的抗原、毒素、类毒素、免疫血清、抗毒素、细胞因子制品、血液制剂、酶制剂等不耐高温的溶液，多采用滤

4、过除菌法达到灭菌的目的。,用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到除菌目的。,滤过除菌法必须通过滤器才能达到除菌目的。滤菌器的种类很多，如薄膜滤菌器、Seitz滤菌器、玻璃滤菌器等。,14,滤菌器,适用范围,血清、毒素、抗生素以及空气等的除菌。,含有微细小孔 0.22m，只允许液体或气体及孔径 0.22m 的颗粒通过，细菌不能滤过。,（1）薄膜滤菌器,滤膜都是由高分子聚合物制成，如醋酸纤维、巨砜及聚亚乙烯氟等。这类滤膜可耐121高压蒸汽灭菌。 用于除菌的膜孔径为0.22m。（更高要求0.15m ）醋酸纤维平面膜装在不锈钢支架上进行除菌过滤。巨砜与聚亚乙烯氟滤膜更具有化学稳定性，可用酸或

5、碱清洗处理，而且聚亚乙烯氟滤膜可以反复灭菌重复使用。,16,（2）Seitz滤菌器,滤菌器用金属制成，中嵌以石棉滤板。滤板的孔径分三级：K最大，澄清用；EK较小，可除去一般细菌；EK-S最小，可阻止所有细菌甚至大的病毒通过。由于石棉是致癌物质，石棉滤板在国际上已禁止使用。无石棉的Seitz滤板仍可应用于生产。,（3）玻璃滤菌器,滤板系用玻璃细砂在一定温度下压成滤板，镶嵌在玻璃漏斗中制成玻璃滤菌器。按孔径大小一般分为G1G6六种型号，G5和G6的滤器能阻止细菌通过。,（二） 化学消毒灭菌法 （1）含氯消毒剂 （漂白粉） （2）过氧化物类消毒剂 （3）醛类消毒剂（甲醛） （4）杂环类气体消毒剂（环

6、氧乙烷） （5）醇类消毒剂 （6）季铵盐类消毒剂 （新洁尔灭） （7）其它消毒剂（洗必太、碘酊）,常用消毒剂的主要种类,各种消毒剂的应用,四、生物制品的抑菌防腐,(1)硫柳汞（0.01%）,(2)氯仿（0.5%）,(3)硝酸汞苯,(4)石炭酸,(5)福尔马林,除活疫苗及冻干制品均加防腐剂,常用生物制品防腐剂主要种类及用途,新型消毒剂（无污染消毒剂）,臭氧O3（O3 = O2 + O） 1、绿色消毒剂 2、新生态氧，破坏膜结构及膜内脂蛋白、脂多糖，直接破坏病毒DNA和RNA 3、瞬间杀毒，杀菌能力是氯的6003000倍 4、应用广泛,25,双锥常温臭氧灭菌罐,26,选择适当防腐剂,低毒,低破坏,

7、有效,价廉,方便,易贮存,第二节 生物制品无菌试验,生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。,生物制品无菌试验：生物制品在制造过程中按各个制品制造及检定规程规定进行的无菌试验。,一、抽样,（一）原液及半成品,原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于1.0ml。,1、大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。,2、原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。,10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）,（二）成品 每亚批均应进行无菌

8、试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。,分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支,101500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶）,50110000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶),30,冻干血液制品无菌抽样,冻干血液制品,1、单瓶装量20ml以上的冻干血液制品,每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶,200瓶及以上者抽检4瓶,2、单瓶装量620ml的冻干血液制品抽检量加倍。,3、单瓶装量5ml及5ml以下者，按一般成品抽检量 抽检。,（三）凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。,（1）检查制品中本身菌体是否存活应采用适于本菌发育生长的培

9、养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。 检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。,二.无菌试验用培养基,检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培 养基。 检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙 醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大 琼脂含量，做成斜面。 （2）检查支原体应采用猪胃消化液半固 体或牛心消化液半固体培养基。,（3）生物制品无菌试验用培养基可用经检定合格的干燥培养基配制。 （4）无菌试验培养基的灵敏度。乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到1

10、0-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。,（5）生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门一同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用。 （6）各生产单位质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。,三、无菌试验方法,（一）直接接种法 1、菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品,每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml,装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml,装量不足0.5ml者，全部吸取。,含防腐剂的制品接种量与培养基的比例： 用苯酚或氯仿作

11、防腐剂者至少为1:20； 用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1:50。 先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，2025培育34天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。,（1）含防腐剂的制品,（2）不含防腐剂的制品,不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合。 装量在5.0ml以上者每7支安瓿混合。 将混合后的样品直接接种一组培养基分别置2025、3035培育，培育时间共为8天。,（3）混浊和接种后不能判定结果的制品 可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，34天后移种。培

12、养基种类和支数、培育温度同含防腐剂的制品，培育8天后判定结果。,样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量,120ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。,2、血液制品,应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。 接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置3035培育，其余置2025培育，改良马丁培养基置2025培育，培育时间不少于14天。,（二）薄膜过滤法：,滤膜孔径为0.220.3m。规定抽检样品数：,每瓶装量100ml及100ml以下者取全量,100ml以上者取半量,加入灭菌薄膜过滤器内，加压或

13、减压过滤。 最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器。,无菌取出过滤后的滤膜在培养基中培养。,人血白蛋白、人丙种球蛋白,42,四、无菌试验判定 （1）无杂菌生长判为合格。 （2）如有杂菌生长，可复试，但抽样量加 倍。如复试仍有杂菌生长，判为不合格,第三节 生物制品热原质试验,热原质：菌体中脂多糖，多数由革兰阴性菌产生，注入人或动物体内能引起发热反应的物质。,生物制品热原质试验概念,将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，在规定期间内观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含热原质的限度是否符合规定的一种方法。,X,一、供试家兔,健康无伤，雌者无孕。体重1.72.5kg。,测温前至少3日应用同一饲料喂养。

14、此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常。,未曾用于热原质试验的家兔，应在试验前13日内预检体温一次，不注射药液。1h测温1次，连续测4h。4h内体温均在38.039.8 ，且最高与最低温差不超过0.5 者方可使用。,动物自动测温仪,48,凡热原质试验用过的家兔，若供试品判为符合规定，家兔休息48小时后可重复使用。对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用。,二、试验前准备,(1)试验用的注射器、针头及一切与供试液接触的器皿，洗净后应经250至少30分钟或180至少2小时干烤灭热原质。 (2)测温探头的精确度应为0.1。每只家兔注射前、后应使用同一支测温探头。,(3

15、)热原质检查前12日，供试验用家兔尽可能处于同一温度环境中。实验室温度保持在1525。试验的全过程中室温变化不得大于3， (4)应保持安静，避免强光照射和噪音干扰。空气中氨含量应低于20ppm。,三、试验,试验前家兔应禁食2小时以上再开始测量正常体温，共测两次，间隔3060分钟，两次温差不得大于0.2；同组兔间正常体温之差不得大于1.0。用测温探头测量时，家兔固定3060分钟后开始检温。,每批供试品初试用3只，复试用5只家兔。,测家兔正常体温后15分钟内，按规定剂量自耳边静脉缓缓注入预热至38的供试品，每隔30分钟测量体温1次，连测6次。,四、结果判断,每只兔的正常体温与注射供试品后最高升温之

16、差，为该兔的应答。出现负值的规定如下：降温值0.4为兔温正常波动范围，以“0”计。降温值0.6需重试。降温值0.4-0.6时，若供试组家兔中仅一只降温在此范围内，以“0”计，若供试组家兔中有2只或2只以上降温在此范围内，应重试。,（一）肌内注射制品判定标准,1、初试结果判定 符合下列情况之一者，判为合格：,3兔升温均低于0.8，且3兔升温总和不超1.8,3兔中1只升温达0.8，其他升温均低于0.8，并且3兔升温总和不超过1.8。,特殊者按指定标准：干扰素单只不超过0.6 。,3兔中有2只升温0.8或0.8以上；3兔升温总和超过2.4。,3兔中1只升温超过0.8；3兔升温总和超过1.8。,有下列情况之一者，复试一次：,有下列情况之一者，判为不合格：,2、复试结果判定 符合下列情况者，判为合格：,初、复试8兔中，有2只或2只以下升温0.8或0.8以上，并且升温总和不超过4.0。,有下列情况之一