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1、第一部分微生物工程原理 第一、二章微生物工程概论、生产菌种的来源 SOS 生色检测法 ：利用 DNA损伤时，可活化 yecA 蛋白，进而分解噬菌体的阻遏 蛋白，再引起 sifA(sulA)基因启动子启动 LacZ 基因的表达，从而达到检测能损 伤 DNA 的抗肿瘤药物的目的。 生化诱导分析法 (BIA) ：采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的 转录和表达的酶活性的方法。 1、微生物工程的应用领域有？ （1）在食品工业的应用 微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位。食品 加工、含醇饮料、发酵乳制品、调味品等 （2）在医药卫生中的应用 抗生素、氨基酸、维生素、生
2、物制品、酶抑制剂 （3）在轻工业中的应用 糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶等 （4）在化工能源中的应用 醇及溶剂、有机酸、多糖、清洁能源等 （5）在农业中的应用 生物农药、生物除草剂、生物增产剂等 （6）在环境保护中的作用 污水处理（厌气法、好气法） （7）在高技术领域中的应用 基因工程的各种工具酶等 2、抗肿瘤药物产生菌的分离原理 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，大 部分具有抗菌或抗真菌的活性，现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤 药物的方法，如生化诱导分析法、 SOS生色检测法 生化诱导分析法 （BIA） ：采用测定溶
3、原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的 转录和表达的酶活性的方法。将E.coli lacZ 连接在 噬菌体的 PL启动子下， 当 DNA 损伤时，诱发阻遏蛋白 CI 分解， PL 启动子启动 lacZ 基因转录，表达 出 - 半乳糖苷酶。测定 - 半乳糖苷酶活性， 可检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药物的存 在 X-Gal。作显色底物；反应后呈蓝色 SOS 生色检测法 ：利用 DNA损伤时，可活化 yecA 蛋白，进而分解噬菌体的阻遏 蛋白，再引起 sifA(sulA)基因启动子启动 LacZ 基因的表达，从而达到检测能损 伤 DNA 的抗肿瘤药物的目的 3、利用 DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物
4、的筛选原理 生物- 两个以上的 DNA 修复基因， 一个 DNA 修复基因损伤或变异， 仍能存活， 但 对能引起 DNA 损伤的化合物十分敏感，易发生死亡 4、抗病毒药物产生菌的筛选分离方法 （1）作用于核酸的方法 - 药物毒性高； （2）小平板测定由病毒引起的细胞变性效果(CPE)； （3）病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂 第三章 优良菌种的选育 结构不稳定： 由于重组质粒 DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。 分裂不稳定：由于细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失 准性生殖：指真菌不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖过程包括异核体的 形成、二倍
5、体的形成和体细胞的重组. 互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基错配。 多因素低剂量的诱变效应： 指在自然环境中存在低剂量的宇宙射线、各种短波辐 射、低剂量的诱变物质和微生物自身代产生的诱变物质等的作用引起的突变。 自然选育： 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程 1、提高质粒稳定性的方法？ 两阶段培养法：一增加菌体、二诱导外源基因表达 适当培养条件：温度、 pH、培养基组分和溶解氧等 2、质粒不稳定的产生原因？ 质粒不稳定 - 分裂不稳定的两因素： 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小 低拷贝 - 产生不含质粒子代菌频率
6、高；高拷贝- 比生长速率低 拷贝数与工程菌本身特性、培养条件有关 3、影响外源基因在酵母中表达的因素？ 因素：外源基因的拷贝数、表达效率、外源蛋白糖基化、宿主菌株的影响 （1）外源基因的拷贝数：应协调- 稳定性、拷贝数、细胞生长量、表达效率 （2）外源基因的表达效率：与启动子、分泌信号和终止序列有关 启动子： 上游激活序列 +近端启动子（ TATA序列、起始密码子），分为组成型、诱导型 启动子（可改变表达效率） 分泌信号：信号肽、前导肽部分编码序列，分泌过程- 加工切割 - 正确产物 终止序列：保证适当终止加Poly(A) 尾巴-mRNA比较稳定 （3）外源蛋白的糖基化 糖基化 -N- 糖苷键
7、、 O-糖苷键 氨基末端修饰 - 二硫键形成 - 蛋白质折叠 - 糖基化 - 分泌 （4）宿主菌株的影响 菌特点：生长能力强、源蛋白酶弱、菌株性能稳定、分泌能力强等 4、酵母菌的载体系统？ 酵母载体多为穿梭载体 - 同时有细菌和酵母的复制原点和选择标记- 能在细 菌和酵母中 - 复制和表型选择 (1) 克隆载体的复制序列 - 四类 酵母附加体质粒 (YEp类) 复制序列 - 酵母源 2um质粒成分，拷贝数约为5-50 酵母复制型质粒 (YRp类) 复制序列 - 非 2um来源的自主复制序列 (ARS)，来自酵母染色体或其他生 物；稳定性差，拷贝数少 酵母着丝粒质粒 (YCp类) 复制序列 -A
8、RS，有酵母染色体中心粒成分， 以一种类似染色体的单位参与 细胞的有丝分裂和减数分裂，稳定性好，拷贝数一个 酵母整合型质粒 (YIp 类) 载体有与酵母染色体重组的序列- 整合到染色体中，具有很好的稳定性， 拷贝数个 (2) 表达载体 在克隆载体中插入酵母的表达盒和终止子等调控序列，即可构建成酵母的表 达载体。表达盒包括酵母菌强启动子多克隆位点的3端非编码区。 5、在大肠杆菌中真核基因的表达形式 三种表达方式：即融合蛋白、非融合蛋白、分泌型表达蛋白 （1）融合蛋白 ：指蛋白质的 N端是一段原核 DNA 序列，C端接上真核基因序列。 优点：基因操作简便、表达蛋白较稳定、可高效表达；缺点：因有原核
9、序 列- 免疫原性 - 只能作为抗原用；切除- 原核多肽 - 具有生物活性的 真核蛋白 （2）非融合蛋白： 在大肠杆菌中以真核蛋白mRNA 的 ATG密码子为起始表达的蛋 白质，保持蛋白质原有的生物活性，但易被蛋白酶降解。N末端有甲硫氨 酸，能引起人体免疫反应。 （3）分泌表达： 通过将外源基因连接到编码原核蛋白信号肽的下游来实现。常 用信号肽：碱性磷酸酶 (phoA) 、膜外周质蛋白 (OmPA) 、霍乱弧菌毒素 B 亚单位 (CTXB)等及大白鼠胰岛素原信号肽。 6、真核表达系统包括 酵母：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小， 仅为大肠 杆菌的 4 倍；世代周期短；有单倍
10、体、双倍体两种形式；生长繁殖迅速，容易 培育，不产生有毒物质，基因工程操作方便，与原核生物相似；表达产物能够 糖基化； 丝状真菌：特点是有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工- 剪切 和糖基化等 转录和翻译 - 进入周质 - 信号肽酶识别 - 切掉信号肽 - 生物活性 7、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数：基因拷贝数增加- 基因表达产物产量 -增加 （2）外源基因的表达效率 影响表达效率因素：启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD序列 和起始密码子 ATG之间的距离、密码子的组成 启动子 - 转录水平上影响基因表达； 有强弱之分；下游应有转录终止子； SD序
11、列和起始密码子ATG 之间的距离及序列 -mRNA 翻译成蛋白质的效 率有明显影响 消除核糖体结合位点及其附近的潜在二级结构 密码子组成影响翻译效率-偏爱性 （3）表达产物的稳定性 提高稳定性 - 避免蛋白酶降解：产生融合蛋白；表达在胞浆周质的空隙； 改变真核蛋白二硫键的位置；选用蛋白酶缺陷型菌 （4）细胞的代负荷 减轻负荷：将细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 8、原生质体制备与融合方法 （1）原生质体制备 : 酶解出发菌的细胞壁 - 高渗溶液中 - 释放原生质体 革兰阳性细菌 - 用溶菌酶；革兰阴性细菌 -EDTA+溶菌酶；链霉菌 - 在含 甘氨酸的培养基中培养后用溶菌酶；酵母- 巯基乙
12、醇 +EDTA 的溶液中培 养，用蜗牛酶或纤维素酶；霉菌- 几丁质酶、纤维素酶 （2）原生质体融合和再生 A. 融合方法：化学因子（聚乙二醇） 、电场诱导、生物因子（仙台病毒） ； B. 再生：涂布在高渗培养基上培养 （3）融合子的检出 在选择性培养基上检出，通过两个遗体标记互补确定 9、原生质体融合的优越性 受接合型或致育型的限制小， 两亲株没有供体和受体之分， 有利于不同种属微 生物的杂交 重组频率高于其他杂交方法: 原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换 的主要障碍， 也避免了修复系统的制约； 再加上促融剂的诱导作用， 重组频率 显著提高 遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质
13、配。 可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后使其融合， 筛选再生重组子菌落，提高筛选效率 用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率 10、酵母菌交配方式 孢子与孢子、单倍体细胞与孢子、细胞间 11、原核表达系统包括 大肠杆菌： 最常采用的原核表达系统； 有细胞不溶性表达 ( 包含体） 、胞可溶性 表达、细胞周质表达；无信号肽；不存在翻译后修饰作用；存在毒素。 枯草芽孢杆菌：分泌能力强；不形成包含体；有很强的胞外蛋白酶，会对产物 进行不同程度的降解 链霉菌：不致病、使用安全；分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外；有糖基 化能力等 12、霉菌的杂交步骤 异核体形成： 在基本
14、培养基上接种两个营养缺陷型亲本，强迫其进行营养互补 双倍体的检出： A. 扇面- 挑出孢子 - 分离纯化 - 双倍体。 B. 异核体菌丝打碎 - 基本培养基和完全培养基 - 分离异核体菌落 - 原养型 扇面分离纯化。 C. 异核体孢子 - 涂布基本培养基 - 原养性菌落中分离纯化 - 杂合双倍体。 分离子的检出： 杂合双倍体单孢子 - 完全培养基平板菌落成熟- 从斑点处 挑取孢子 - 完全培养基斜面 - 纯化和鉴别 - 分离子 13、组成型突变株的筛选 调节基因或操纵基因发生突变，都有可能获得组成型突变株 筛选原则：设计某种有利于组成型菌株生长， 并限制诱导型菌株生长的培养条件， 造成组成型菌
15、株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株 14、诱变后的突变菌株包括？ 营养变异、抗性变异、代变异、形态变异、生长繁殖变异和发酵温度变异等 15、优良菌种的基本特性 菌种的生长繁殖能力强， 具较强的生长速率， 产生孢子的菌种应具有较强的产 孢子能力。 菌种的培养基和发酵醪原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动 敏感性较小。 对需要添加的前体物质有耐受能力，且不能将这些前体物质作为一般碳源利用 菌种应具有在较短的发酵周期产生大量发酵产物的能力。 能高效地将原料转化为产品。 这样可以降低生产成本， 提高产品的市场竟争力。 在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物
16、及其它产物。 在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数， 提高单罐产量， 降低成本 具有重要意义。 具有抗噬菌体感染的能力。 菌株遗传特性稳定， 以保证发酵能长期、 稳定进行，有利于实施最佳工艺控制。 菌种纯粹，不易变异退化， 不产生任何有害生物活性物质和毒素，以保证安全。 16、简述放线菌的四种遗传体系和杂交方法 （1）遗传体系 异核现象： 菌丝间的接触和融合形成异核体，在同一条菌丝或细胞中含有不同 基因型的细胞核。 接合现象： 菌丝间经接触和融合以后， 相同细胞质中不同细胞核在两者增殖过 程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。结果是部分合子形成。 异核系的形成： 当部分合子形成后， 就会产生杂合的无性繁殖系，即异核系的 细胞核。细胞核是经过一次单交换而产生的异核系染色体组，有一个二体区。 过度阶段菌落很小，不稳定。其分生孢子影映在同样的培养基
