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1、1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序 主要包括四个步骤：,（1）目的基因的获取 （2） （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定,基因表达载体的构建,一、目的基因的获取,2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么叫基因文库？,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（1）基因组文库的
2、构建模式图,通过对 受体菌 的培养而储存基因,以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。,（2）cDNA构建方法-反转录法,基因组DNA文库,cDNA文库,（3）基因组DNA文库与cDNA文库的构建,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧
3、接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,终止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚
4、合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基
5、因表达的计算,在真核生物中，对应的是 的碱基数,631,氨基酸数,碱基数,？,补充资料,基因中外显子,思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。,注意：,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,（1）鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),多用于原核生物, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。
6、,多聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,原理：_,DNA复制,前提条件：_；,有一段已知基因的核苷酸序列,（二）利用PCR技术扩增目的基因,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,变性,退火,延伸,（二）利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在_作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的
7、作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,高温,原料：_、_ 、 _、 _。,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内大量扩增,模板DNA,PCR的基本反应步骤,变性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,PCR总结：,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA
8、分子,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（三）化学方法人工合成目的基因,人工合成,(基因比较小，核苷酸序列已知),DNA合成仪,从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 用_切割目 的基因，使其产生_ _。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA
9、分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端或平末端,同一种限制酶,相同的黏性末端或平末端,切口,DNA连接酶,1.过程:,二、构建表达载体, 核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,过程:,2.构建基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基
10、因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,思考3：标记基因有什么作用？,载体与表达载
11、体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意,用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将
12、目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法（最多）,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力, Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色体DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因
13、枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态
14、细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？,用Ca2处理，增加细菌细胞膜的通透性,Ca2+处理,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,一定 温度,重组表达载体DNA溶于缓冲液,受精卵 体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注 射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,归纳：,四、目的基因的检测与鉴定,分子检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 个体生物学水平鉴定,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因, 首先取出转基因生物的基因组DNA；,（1）方法:,DNA分子杂交（DNA-DNA),（2
15、）过程:, 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；, 使探针和基因组DNA杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。,（一）检测,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,分 子 杂 交(mRNA-DNA),方法:,抗原-抗体杂交,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,过程:,从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带,表明目的基因已形成蛋白质产品。,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因 的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,（二）鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,目的基因的表达和检测,转基因生物的DNA上是否插入目的基因,DNA分子杂交 （DNA和DNA之间）,目的基因是否转录出mRNA,分子杂交技术 （DNA和mRNA之间）,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交,提示： DNA分子杂交技术首先提取转基因生物的DNA，然后高
