{设备管理}植物组织培养实验室的组成仪器设备及基本操作

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1、植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作,一、植物组织培养实验室的结构及设计要求： 完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室、接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际需要和条件进行设计。 但从功能上至少包括准备室（化学实验室）、接种室以及培养室三部分，并且按顺序排列。 在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。,第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术,（一）准备室（化学实验室）： 1. 主要功能： 用于培养器皿的清洗、干燥、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。,2. 主要仪器设备及用品： 药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿（烧杯、量

2、筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）、蒸馏水制造装置。 天平、移液器、 pH计、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培养基分装用品等、高压灭菌锅、 冰箱。,（二）接种室（无菌操作室）： 1、功能： 接种材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。 接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。,2、仪器设备及用品： 超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。,（三）培养室： 1、功能： 主要用于植物材料的培养。 要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度，以促进植物材料的生长和分化。,2、仪器设备及用品

3、： 培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱等。,（四）细胞学实验室： 1、功能： 主要用于培养材料的显微观察及照相等。,2、仪式设备及用品： 体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套制片及染色用品等。,体视显微镜,用途：放大倍数580倍主要用于植物形态分化的观察、茎尖的切取。,普通光学显微镜,用途：用于植物切片观察，确定植物的发育进程，如：不定芽、不定胚的分化过程以及其它器官组织的分化等。,倒置显微镜,用途：主要用于细胞、原生质体的细胞分裂和细胞团形成的观察。,（一）洗涤： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、

4、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。 2. 难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。,重铬酸钾洗液的配制方法：43g重铬酸钾溶于1000ml蒸馏水中，将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾溶液中，浓度比例为1：1。,二、实验室基本操作：,1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。 （1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 保温2小时，成本较高。 （2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 1520分钟 。 （3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。,（二）灭菌： 灭菌 是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物（

5、包括芽胞），使之呈无菌状态。经过灭菌的物品称“无菌物品”。,2、培养基灭菌： 采用高压蒸汽灭菌。120 1520分钟。 培养基体积越大，灭菌时间越长。,高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。 c.不少培养基颜色加深。 d.体积和浓度有所变化。 e.营养成分有时受到破坏。,3、不耐高温材料的灭菌： 采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机添加物等。,4、外植体的表面灭菌： 采用7075乙醇（10-30秒）、有效氯1的次氯酸钠（5-30分钟）、0.10.2%的氯化

6、汞（2-15分钟）等杀菌剂中加入几滴吐温20或80（Tween20或80）效果较好。,（三）无菌操作： 1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。 2、保持超净工作台的洁净：接种前用70乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。,3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。 4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，以减少污染源。 5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。,第二章 植

7、物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作,第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术 一、植物组织培养实验室的结构及设计要求 二、 实验室基本操作,第二章 植物组织培养实验室的组 成、仪器设备及基本操作,第二节 培养基的组成、配制与灭菌,一、培养基（medium）的组成和作用,通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。,培养基的主要指标是: 营养成分的浓度 植物生长调节物质的浓度,（一）矿质营养： 矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。,矿质元素的生理作用： （1）组成各种化合物，成为结构物质； （2）许

8、多酶和附酶的组成部分，参与代谢； （3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用； （4）影响形态发生和组织、器官的建成等。,根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。 国际植物生理学会规定植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为微量元素。 大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分别占植物干重的百分数为18、10、70、0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。,1、大量元素： N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各

9、种无机盐提供。 不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。 目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以MS应用最广泛。 以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。,大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对有些植物的培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、丝氨酸等来代替。,2、微量元素： 植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。 各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物

10、的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。,微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高pH下，FeCl3极易形成Fe（OH）3沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。,（二）有机成分： 主要包括各种维生素和氨基酸 常用的维生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、烟酸（VB3）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量101000mg/

11、L, 通常用于原生质体等培养。 此外肌醇是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡，糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理作用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化。,（三）植物生长调节物质： 植物激素是植物代谢中产生的天然化合物，它能直接影响植物细胞的分化、分裂以及影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。 在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。,常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素： 1、生长素类： 2、细胞分裂类： 3、

12、赤霉素类： 4、脱落酸： 5、多胺 6、乙烯：,1、生长素类： 组织培养中的功能是：促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4D等。,2、细胞分裂素类： 功能：诱导芽的分化、促进侧芽萌发；促进细胞分裂和扩大，促进茎增粗，抑制茎伸长；延缓衰老。 常用细胞分裂素有BA、KT、ZT、2ip等。,此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。 如TDZ，CPPU，4PU等。,3、赤霉素类： 主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等

13、。,4、脱落酸（ABA）： 促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于种质资源的离体保存。,5、乙烯： 主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。,（四）碳源： 碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。 常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在1050g/L，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。,（五）琼脂： 琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。 琼脂的用量通常在410g

14、/L。,（六）有机附加物： 1、椰子汁： 用量为100200g/L。 2、香蕉泥： 使用量为150200g/L。 3、苹果汁、番茄汁等。,（七）其他成分： 1、活性炭：使用量为0 .2-1%。 2、抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L。 3、抑制酚类物质：抗坏血酸. 4、生长抑制剂： 常用矮壮素、比久（B9）、多效唑（pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等.,二、培养基的类型： 1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。 适用于多数营养需求量较大的植物。 2、低盐培养基：WPM、 White、 Nitsh等。 适用于木本植物的培养。,表3 N6培养基的组成和配方,三、培养基

15、母液及激素母液的配制： 由于培养基中元素用量少，种类多，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有机营养 激素,1、器皿和用具的准备 仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计 用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴管、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围pH试纸、铅笔等。 玻璃器皿用前清

16、洗干净。,2、药品及蒸馏水准备： 药品采用分析纯或化学纯试剂。 水利用蒸馏水或去离子水。,3、母液配制： （1）配制母液原则：,相同类型的试剂混合； 易形成沉淀的药品分开； 母液浓度要适宜； 用量要认真计算和核对； 药品要准确称量。,（2）MS培养基母液的配制： MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、有机物（100倍）。 配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用万分之一天平称量。,（3）激素母液的配制： 根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。 生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95乙醇溶解；细胞分裂素类用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml, 细胞分裂素母液浓