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1、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,电泳技术 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,电泳技术,电泳技术主要用于物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等实验研究工作中，已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、农业、食品、卫生、环保等学科不可缺少的重要的分离分析手段。,一、电泳技术的原理,电泳是指在外加电场的作用下，带电的物质向其所带电荷相反的电极方向移动的现象。各种物质由于所带净电荷的种类和数目不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同，从而可以对物质进行分离、分析和鉴定。,1带电粒子在电场中移动时，受到两种力的作用。第一种是电场产生的作用力F1，它能使带电粒子移动。F1的大小与粒子所带静电荷q及电场强度E成正
2、比。第二种是移动的带电粒子与溶液介质之间产生的摩擦力F2，它可以阻止带电粒子的移动。F2的大小与带电粒子的摩擦系数f及运动速度v成正比。 F1 = qE F2 = fv,2根据Stokes定律，摩擦系数f与介质的粘度、粒子的形状和大小（球形粒子半径为r）有关，即f = 6 r 。,3 在电场中运动的粒子，其所受到的电场力和摩擦力平衡，即 qE = 6 rv 。变换该式得： qE v = 6 r 因此，带电粒子在电场中运动的速度与它所带的静电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与粒子的大小成反比，即在相同的电泳条件下，只要粒子所带的净电荷不同，或粒子的大小不同，就有可能借助电泳而被分离。,4我们通常
3、使用电泳迁移率M来表示在单位电场中颗粒的迁移速度，即 因此，对于给定的颗粒和电泳条件，电泳迁移率是描述物质在电泳中行为的特征性常数，它表示带电粒子在单位电场强度E和单位时间t内泳动的距离L。,二、影响电泳迁移率的因素,1缓冲溶液 缓冲溶液应选用使分离的物质稳定，而且不与其发生反应的体系。缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。缓冲液的离子强度应在0.050.10mol/L间为宜，过低，产热少，电泳快，区带明显扩散；过高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。离子强度可用表示。（配动图）,2电场 带电粒子在电场中的移动速度，与电势梯度成正比。 因电场中施加的端电压不同
4、，而分为常压和高压电泳。一般在500V以下为常压电泳，电势梯度1020V/cm；500V以上为高压电泳，电势梯度20200V/cm。高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。,3支持介质,支持介质解决了样品扩散问题。一般选用惰性材料，不影响粒子在电场中的迁移率。但有的支持介质仍对样品有吸附和滞留作用，将造成分离物的拖尾现象，影响分辨力。有的支持介质具有电渗作用。所谓电渗是指一种液体相对于带电的支持物的移动现象。是由于支持介质内存在某些可解离的基团所致，将影响带电粒子在电场中的泳动速度或泳动方向。此外，有的支持介质具有分子筛作用，可根据待分离物的分子大小，采用不同的交
5、联度以形成孔径不同的凝胶。粒子在这种介质中电泳时，迁移率不仅与其带电性质有关，而且与它们的分子大小有关。,三、醋酸纤维素薄膜电泳,醋酸纤维素薄膜电泳采用醋酸纤维素薄膜为电泳的支持介质，具有操作快捷简便、染色和脱色较易、背景清晰、区带分明、样品需要量少、介质可以透明后定量扫描等优点，主要用于生物大分子物质的分离分析。,血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,一、原理 二、操作 三、临床意义 四、注意事项,一、原理 以醋酸纤维薄膜为支持物，浸入ph8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上，经电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，洗去多于染料。将膜条烘干，再将其用透明液进行透明处理。用光密度计或凝胶
6、成像系统进行成分分析比较。,二、操作 1、准备与点样 将薄膜切成28cm的膜条。在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样的位置。 将薄膜无光泽面向下，浸泡于巴比妥缓冲液中。 将充分浸透（指膜上没有白色瘢痕）的膜条取出，用滤纸洗去多余的缓冲液。 用X光软片在盛有血清的表面皿中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，在表面皿边缘轻轻刮除多余的血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开软片。,2、电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置阴极。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电
7、流为0.40.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。,3、染色 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染23分钟取出，自来水冲去多余染料，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂洗白净为止。用滤纸吸干薄膜。,4、定量 将吸干的膜条放入干燥箱中，烤干后，放入盛有透明液的培养皿中让其充分浸透，用镊子将其取出，迅速平整的将膜条贴敷于载玻片上，让其自然透明，再将透明的膜条连带载玻片一同放入光密度计或凝胶成像系统中进行定量分析，从而求得各部分蛋白质的百分数。,三、临床意义,1、正常值：白蛋白 5772% 1球蛋白 2 5% 2球蛋白 4 9% 球蛋白 6.512% 球蛋白 1220% 2、异常时： 慢性肝炎和肝硬化：白蛋白显著降低，2和球蛋 白无显著变化，球蛋白升高23倍。 肾病综合症、慢性肾小球肾炎：白蛋白降低，2和 球蛋白升高。 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白显著升高。,四、注意事项,1、拿取薄膜条一定要用镊子，严禁用手指 直接碰触膜条，以防手指皮肤上的氨基 酸污染。 2、电泳电压不能过高，防止蛋白区带发生 拖尾现象 3、电泳完毕取膜条时防止高压电击。,
