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1、浅谈石蜡切片的制作与存在问题摘要:石蜡切片是观察植物组织构造常用的制片方法之一。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此, 观察植物叶片结构结果显示，组织经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤后完好保存细胞原有状态，而且能清晰辨认其形态结构。关键词：石蜡切片；组织；染色；形态结构石蜡切片(paraffin section)石蜡制片又叫永久制片,组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。其优点主要是适合各种植物组织的制片,切片的厚薄易于控制(最薄可达015m) ,清晰度很好,亦适合作
2、细胞学研究,并能够制成连续切片,制片易于长久保存,易于交流等。但制片周期较长,易受条件限制,制片中使用化学试剂较多,对人有一定毒害,易使材料变脆、变硬或变形,某些内含物易于消失,常使组织变小,甚至使组织扭转变形,细胞所含物质缩小而折光性增强,影响观察正确性,且制片成本较高等。一、植物组织制片技术的概述植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，使人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分1。切片技术是生物科学工作者特别是植物学工作者常用的一种实验手段。随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用，石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中，做为基础技术提供有效的实验
3、或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中，可对材料中被杂交的DNA 分子进行定位、含量分析或观察基因表达（mRNA）水平；聚合酶链式反应（PCR）技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA 分析，使研究进入了分子水平，但在短期内这些技术尚不能做常规使用2。迄今为止, 植物制片技术已建立了许多方法，多采用的有徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡切片法等3，其中最常规的为石蜡切片法。然而采用常规石蜡切片法包埋及染色所需的时间太长、太繁琐，有些质地过硬的材料也不宜使用。本研究同样采用此方法，并在方法上进行了一些改进，其周期短成为该法的显著特点，8-10 天即可完成整个制片过程
4、，同时还节省了试剂6。二、实验器具与试剂21 器具石蜡切片机、烘箱、切片刀、恒温展片台、蜡杯、酒盅若干、酒精灯、蜡铲、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、台木、树胶、脸盆、包埋纸盒、吸管、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。22 试剂1%番红、1%固绿、各浓度的酒精（无水乙醇、95%、85%、80%、70%、50%、30%）、FAA 固定液、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、郝普特氏粘片剂、蒸馏水、中性树胶等。3 实验材料选择植物健康、标准、具代表性的部分4。如果不是为了特别目的，不能用一些病态的不正常的材料。采下的材料应尽快浸入固定液固定。本实验采用几种针茅（Stipa.）的叶片进行石蜡制片，材
5、料直径1mm 左右，长0.8-1.0cm。4 实验步骤41 固定所截取得材料应迅速投入固定液。选择固定液的原则就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。因此植物材料不同，应选择不同的固定液。我们选择FAA 固定液对针茅叶片进行固定，FAA 固定液是最常用的一种固定液， 其用量最少应为所固定材料的总体积的20倍，应该使植物材料四周都能浸泡在固定液里，这样能在短时间里使固定液浸透材料。植物材料固定后，若不立即制片，可以保存在固定液中，或转至70%
6、酒精溶液中保存7。42 脱水及透明将材料从固定液中取出后，进行植物材料脱水，其具体流程如下：A：酒精X：二甲苯70%A（2h）70%A(2h)70%A（2h）80%A（过夜）85%A（2h）95%A+伊红（2h）100%A（1h）100%A（1h）1/2A+1/2X（1h）1/2A+1/2X（1h）X（1h）X（1h）。设置浓度梯度是为了防止材料皱缩，但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定，对于幼嫩的材料，梯度要大些，各步浸泡时间可短些， 老的硬的梯度则要小些， 各步浸泡时间则相应要长些。第二次100A 脱水很关键，一定要确保水脱尽。43 渗蜡将透明的材料用镊子取出放进蜡杯中， 再把碎石蜡（
7、熔点48-50）用蜡铲放到蜡杯2/3 为止，加盖放入37温箱，放置24 h 进行溶蜡。24 小时后去掉蜡杯的盖子， 之后再将温箱温度调至56放置5天，使其透明剂充分挥发。取若干个酒盅将材料转移至盛有熔点为60-62石蜡的酒盅里，温箱温度调到70，2h 换一次熔点60-62的石蜡， 换三次即可进入包埋程序。4.4 包埋4.4.1 折包埋纸盒包埋前应先准备包埋用的纸盒。纸盒用较硬而光滑的纸折成，大小根据植物材料的大小而定，这里用6cm1cm1cm 的纸盒。4.4.2 植物材料包埋将纯石蜡倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，进行包埋5。稍微凝固后倒置于清水盆
8、中彻底冷却凝固。在常规石蜡包埋中最困难的是碎小组织、纤细叶片的包埋，可以在纸盒里倒入少许的石蜡，是材料基部固定住后，再倒石蜡至完全覆盖住材料。4.5 修蜡将包埋好的材料从摆卖纸盒里拖出蜡块， 用双面刀片切割成小块，刀片不宜太厚，以免材料从蜡块中脱落。每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡铲将其固定在木台（2cm2cm2.53cm）上，植物材料的切面与木台的粘贴面平行。4.6 切片将粘有蜡块的小木块至于切片机上固定， 调整切距到适当大小，转动调节器调切片厚度8m 进行切片。注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条
9、蜡带。切片过程中，如果蜡带偏向一边，也要及时修正蜡块，从而保证切片的连续性。4.7 粘片及烘片滴一滴粘片剂于干净载玻片中央，用干净的擦镜纸涂抹均匀后，滴上蒸馏水，将取下的具代表性的蜡带切成小段置于载玻片上（放上四至五段），然后将载玻片放到恒温展片台上(保持40)烫片。待充分烫平后将其移至边缘试玻片上的水分充分烘干。之后将切片放置15天自然晾干或取代为31 温箱烘干一天。烫片时要注意把握时间，不能烫片过度，但要保证充分烫平。4.8 脱蜡及染色将玻片标本放于切片框里待进行脱蜡于染色步骤， 具体步骤如过一下)85%A(过一下)50%A（过一下）30%A（过一下)1%番红溶液(4h)蒸馏水（迅速）50
10、%A+HCI （迅速）95%A+氨水（迅速）1%固绿（95%A 配制）(30s)95%A (1min)100%A (过一下)100%A(过一下）50%X+50%A(过一下)100%X(过一下)100%X(过一下)。注意番红染色时间要长些（至少3h 以上），随后的两次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时间大约在20-30s，均要视具体情况而定。4.9 封片从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进行封片。酱油植物切片的玻片平置于实验台上， 在上面滴一滴树胶于玻片中央位置，使其慢慢向外溢，用镊子取干燥的或浸在75%乙醇中的盖玻片，从植物切片的一侧呈一倾斜的角度接触树胶，慢慢盖上，
11、待整个盖玻片的内表面全部接触树胶后，用镊子轻轻盖压玻片，赶出切片中的气泡，并使树胶曾尽可能薄而均匀。注意封片用的该玻片要清洁，封片时要注意不要产生气泡。三、石蜡切片制作中的问题与解决石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普遍应用的一种方法。优质切片的标准是切片要平整、无刀口、无划痕、无皱褶, 染色鲜明、清晰, 红蓝对照明显。但制作石蜡切片程序较多, 步骤复杂, 无论哪个环节出现问题, 都会影响切片整体质量。影响切片质量的因素很多:1、脱水脱水过程中出现的问题主要是脱水不净和过度硬化,脱水不净时二甲苯不能渗入,蜡液不能渗入组织,可导致切片困难,切出的片子在染色时易脱片。而组织蜡块与空气接触后也会因水
12、分蒸发而凸陷,故脱水时一定要保证脱水液浓度达标,经常更换新液,遇脂肪组织或疏松的纤维组织宜加长脱水时间。组织在纯洒精中放置的时间也不能过久,否则会造成过度硬化,另外为防止组织过硬,对于比较柔嫩的组织,其起始的脱水洒精浓度可低于70 %8。2、透明二甲苯是最常见的透明剂,但其收缩性强,极易使组织变脆,故在这一过程中要严加控制,一般30 分钟就可达到透明的程度,但温度较低时可适当延长时间或置于温箱中加热,另外在透明过程中还要注意更换二甲苯,有时甚至更换二、三次以上,每次10 分钟左右,如二甲苯为旧液体,应选择多的更换次数。3、浸蜡、包埋浸蜡和包埋要一次完成,要尽量在恒温下操作,防止中间出现温度差,
13、蜡的温度要适宜,不能过高使组织烫坏或使碎小组织变脆,变硬,也不能温度过低使组织与石蜡脱离,蜡块中不能出现气泡、裂隙,斑点,对于碎小组织要尽可能使其处于同一平面,否则会造成切片不全与漏切,此时要尽可能使碎小组织下沉,并防止其重叠。4、切片手工切片时,用力要均匀一致,不宜过重过猛,容易造成切片厚薄不均,甚至毁坏蜡块。在夏季切片时,为保持蜡块硬度,可把蜡块放于冰柜中,切时取出,组织蜡块四周在切片前应修齐,大小适当,切片机要放稳,不能震动,切片刀要置好,倾斜角要大小适宜,一般以20 30 为宜9。5、染色染色过程中出现的总是较多,除了要防止染色效果不佳外,还要注意不能脱水。为此首先要注意染色液的配制浓
14、度要准确,PH 值要适当,且不能有沉淀。染色前切片脱蜡要彻底。染色时间要根据染液的新旧适当调整,必要时在染色过程中用显微镜观察,染色过程中避免阳光照射。防止脱片的主要措施有:载玻片要洗涤干净,切片贴附时,水温要足够,使切片与玻片贴紧,贴附之后不宜马上染色要烤干。染色过程中,水冲洗不宜太猛。6、封固切片封固不良,易出现色素颗粒、气泡、云雾状物等,其原因大致为:封固时二甲苯已挥发完毕,封固剂过稀,切片厚薄不匀,切片未展开,封固方法不当,组织脱水不净等,故在封固前,当二甲苯挥发后,应重新放入到二甲苯中透明,封固剂要浓度适当,封固时先将盖玻片一侧放置于滴有树胶的组织切片上,然后缓慢放下将空气完全排除,
15、封固时避免水蒸气进入10。我认为制作优质切片的关键在于责任心, 如果每一个人每一天都能真正做到设身处地为患者着想, 严格遵守操作规程, 常规石蜡切片的质量一定会越来越好。参考文献:1王明书，孙敏，白志川.结构植物学试验指导M.西南师范大学出版社，2003.2黄南平.N-烷基-己内酰胺的合成及其在植物材料染色中的应用J.江西科学，2003，21（1）：6466.3荣伟，刘海燕.关于石蜡切片在染色中脱蜡的探讨J.解剖学杂志，200629（1）：91.4叶创兴，冯虎元，等.植物学试验指导M.清华大学出版社，2006.5何凤仙，主编.植物学实验M.高等教育出版社，2000.6丘安经主编.植物学实验M.华南理工大学出版社，2003.7李正理，编著.植物制片技术M.2 版.北京：科学出版社，1987.8龚志锦,詹榜洲主编,病理组织制片和染色技术M . 上海:上海科学技术出版社,1994 ,l 30.9张宜玲,于颖彦,一种改良快速石蜡制片技术J . 诊断病理学杂志,1998 ,5 (3) :169 170.10王伯云,李玉松,黄高,张远强主编,病理学技术M . 北京:人民卫生出版社,2000 ,61 9
