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1、.,蛋白质工程与食品产业,.,蛋白质的功能与结构 蛋白质工程的诞生 蛋白质工程的基本步骤和改造方法 食物蛋白质改性技术 蛋白质工程在食品产业中的应用,.,一、蛋白质的功能与结构,1.1蛋白质的功能 1.2蛋白质的结构,.,1.1蛋白质的功能,(1)蛋白质是构成生命的重要物质之一 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的机体之中，具有许多重要的作用； 生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行； 高等动物免疫反应，主要是通过蛋白质，即抗原和抗体完成； 运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的； 运输氧和二氧化碳的是血红蛋白； 具有代谢和调节
2、功能的是多种蛋白质激素。,.,(2) 蛋白质的应用 蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。 用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗消化不良性疾病；胰岛素用于治疗严重的糖尿病；转氨酶作为肝病变的指标等。 食品工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等（texture）。,.,1.2蛋白质的结构,氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。,肽键的形成,.,肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构，这时才产生具有生物活性的天然蛋白质。 多肽链的折叠可分为四种不同层
3、次的结构。一级结构：仅指肽链中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。,牛胰岛素的氨基酸序列,.,二级结构：主链原子的局部空间排列，不包括侧链构象和与其他链段的相互关系，如-螺旋、-折叠等主链构象单元就是二级结构。,-螺旋,-折叠,.,三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。,碳酸酐酶的多肽骨架示意图,.,四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子中四个
4、亚基之间的空间关系。,血红蛋白的结构,.,二、蛋白质工程的诞生,蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果，通过基因工程技术，改造现有蛋白质和设计制造新蛋白质，因而也称为第二代基因工程。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。,.,内容主要有两个方面： 根据需要合成特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质； 确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间关系； 在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质
5、工程最根本的目标之一。,.,生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工程的诞生： 新的克隆技术，特别是完整cDNA的克隆技术； 快速测定DNA序列的方法； 从DNA序列推算蛋白质序列的计算机程序系统； 蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能被很快地鉴定出来，由此研究其功能上的相似性；,.,对原核生物和真核生物基因表达调控进一步深入了解； 用于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；,.,三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法,3.1 蛋白质工程研究的基本步骤 3.2 蛋白质改造方法,.,3.1 蛋白质工程研究的基本步骤,分离纯化目的蛋白，使之结晶，并作X晶体衍射分析，结合核磁共振等
6、其他方法的分析结果，得到其空间结构的尽可能多的信息； 对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域； 通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分析，找出关键的基团和结构； 借助于计算机图像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建或构建方案，并用基因工程的方法去实施；,.,3.2.2 合成全新蛋白质,基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，而全新蛋白质设计是合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。,.,从头设计一个蛋白质的基本步骤：,构建一个多肽链骨架模型,从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的片段，进行修改和组合,依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定
7、每个残基位置上的氨基酸,优化目标蛋白的三维模型,检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进一步修正,几轮的设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白质,.,四 食物蛋白质改性技术,随着食品工业飞速发展，迫切需要大量具有功能特性和营养特性蛋白质，作为食品原料成分或添加基料； 大力开发具有优良特性蛋白质资源； 对现有蛋白质进行改性，以满足人们特殊需求； 人类食用蛋白质主要有两大类，植物蛋白和动物蛋白 植物蛋白周期短，资源丰富，产量大等优点，在食用蛋白中占70%以上，而动物蛋白则不足30%。,.,蛋白质是由各种氨基酸相互联结而构成的具有空间结构生物大分子。 其
8、理化性质(尤其分子量、氨基酸组成、静电荷和表面疏水性)与功能特性直接相关。 蛋白质改性就是用生化因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理因素(如热、射线、机械振荡等)使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白大分子空间结构和理化性质改变，从而获得较好功能特性和营养特性蛋白质。,.,.,磷酸化作用,磷酸化改性后蛋白中，由于引进大量磷酸根基团，从而增加蛋白质体系电负性，提高蛋白质分子之间静电斥力，使之在食品体系中更易分散，相互排斥，因而提高溶解度，聚集稳定性，降低等电点，而且其净电荷只有在相当低环境中才会被中和，故可有效拓宽在食品中应用范围。 磷酸化改性蛋白由于负电荷引入，大大降低乳状液表面张力，使之
9、更易形成乳状液滴，同时也增加液滴之间斥力，从而更易分散，因此改性蛋白乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。,.,糖基化作用,将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基或羧基相结合化学反应(包括美拉德反应)，为蛋白质糖基化作用； 提高蛋白质功能特性。一般来说，合成糖基化蛋白在较低离子强度或天然蛋白等电点处仍表现出较高溶解性； 糖基化提高蛋白质热稳定性，且随着糖基化程度提高，糖基化蛋白质功能特性也随之提高。,.,蛋白水解作用,采用蛋白酶对蛋白质进行轻微水解，可显著提高蛋白质溶解性能，改善表面/界面性质，水解使蛋白质柔性增大，易于在表面吸附，增强乳化性及起泡能力。 蛋白质水解可能产生免疫调节肽、血管紧张素I
10、转化酶抑制肽、丝氨酸磷酸肽，它们存在于食品蛋白质氨基酸序列中，为非活性状态，但在消化道被释放出来，成为生理调节因子，为食品蛋白质营养价值增添新的内涵。,.,物理改性,物理改性是利用热能、机械能、声波能等进行蛋白质改性方法； 目前较为集中在热变性和挤压蒸煮过程研究； 温度升高对蛋白质中许多化学键都有所影响，故热处理要提高疏水性，同时蛋白质不会发生聚集沉淀。 挤压组织化就是在高温、高压及高剪切作用条件下，蛋白质结构展开，分子重新排列。 挤压引起蛋白质生物价降低要比其它形式热处理为大,.,五、蛋白质工程在食品产业中的应用,在实际生产中，可以应用蛋白质工程对生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，提高现有酶
11、或蛋白质工业实用性： 提高酶的热稳定性（引入二硫键，改善酶热稳定性）。 改变酶的最适pH值条件； 提高酶的催化活性；,.,溶菌酶是一种广泛应用于食品工业的酶制剂，其催化速率随温度升高而升高，因此，它的热稳定性是提高其应用潜力的重要标准。 蛋白质晶体结构研究表明，T4溶菌酶分子的一个重要特性是在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸，所以，设想通过在分子中增加一对或数对二硫键，来提高酶热稳定性。 采用定位突变技术使该菌肽链第9位和第164位氨基酸残基转变为半胱氨酸，并形成一对二硫键，获得的突变体的酶活性高于天然酶6%，熔点温度提高6.4度； 新引入的“工程二硫键”能够稳定两个结构域之
12、间的相对位置，进而稳定了由两个结构域所形成的活性中心。,.,纤维素酶是一类水解纤维素中-1,4-葡萄糖苷键的糖苷水解酶。 根据氨基酸的序列相关性，糖苷水解酶可分为82个家族，其中纤维素酶占其中的13个家族。纤维素酶根据其催化功能的不同，又可分为内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和纤维二糖酶。 自1904年在蜗牛消化液中发现纤维素酶至今已有100多年。对纤维素酶的研究分三个阶段： 第一个阶段是1980年以前，主要的工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化； 第二个阶段是从1980年到1988年，主要的工作是利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定； 第三阶段是从1988年至今
13、，主要的工作是利用蛋白质工程的方法对纤维素酶结构域的拆分、解析、功能氨基酸的确定、水解的双置换机制的确定、分子折叠和催化机制关系的探讨。,.,蛋白质工程的工作： 对潜在活性中心氨基酸残基进行基因定点突变； 体外分子定向进化； 对定点突变酶进行动力学的分析； 通常是用基因定点突变技术对典型纤维素酶家族序列不变残基的确认和三维构象的确认，并通过设计新的三维复合体来对酶进行修整和探索。 迄今为止，纤维素酶已经有10个家族（第5、6、7、8、9、12、26、44、45、48家族）被克隆出来，其中第5、6、7、8、9、45家族已经用蛋白质工程技术进行了研究。,.,微生物脂肪酶是一类能催化水解、酯化、酯交
14、换、转酯、醇解、酸解以及氨解反应等多种化学反应的工业生物催化剂。 脂肪酶催化的化学反应具有化学选择、立体选择性、位点选择性、催化活性高而副反应少、催化反应又不需要辅助因子等特点 广泛应用于食品加工、油脂加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、化妆品、杀虫剂、生物柴油、去污剂、皮革加工、造纸、生物修复、医药、精细化工、去污剂的添加剂、造纸、皮革等诸多工业领域；,.,市场需求量大(仅洗涤剂添加剂一项，每年市场需求量就高达1 000吨)，是大宗工业用酶制剂之一； 脂肪酶催化的化学反应工艺条件，通常是在各种有机溶剂介质(如生物柴油生产中使用的短链醇)、极端酸碱(如废纸脱墨工业中的强碱性)等条件下，容
15、易导致天然脂肪酶的失活，生产成本的升高，从而限制了脂肪酶的大规模应用。,.,目前主要有两条途径提高脂肪酶对各种极端工艺条件的耐受性: 从极端环境微生物中筛选新型的能耐受极端工艺条件的脂肪酶 利用蛋白质工程技术改造和优化现有脂肪酶分子的性能。 极端微生物培养条件苛刻，极端微生物产生极端脂肪酶更具有不确定性(许多极端微生物产生的脂肪酶并不属于极端脂肪酶)，而且开发这类极端脂肪酶的周期长，花费昂贵。 越来越多脂肪酶3D结构的阐明，结合生物信息学，利用蛋白质工程技术，快速设计和改造现有脂肪酶分子，获得新型的高活性和高稳定性的脂肪酶分子，已有许多成功的报道。 脂肪酶蛋白质工程技术包括脂肪酶的化学修饰和脂
16、肪酶的分子进化两种方式。,.,脂肪酶化学修饰,双功能聚合物的化学修饰 双功能聚合物的化学修饰是指利用双功能聚合物如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或在分子内不同肽链之间，共价交联形成交联酶晶体，从而提高酶的稳定性。 用戊二醛制备的洋葱假单胞菌脂肪酶交联酶晶体，其转酯活性提高了12倍。 单功能聚合物的化学修饰 单功能聚合物的化学修饰是将多糖或多聚物如PEG及其衍生物等活化后，与脂肪酶的侧链氨基相互作用，从而将其偶联到酶分子上。 用多糖偶联C. antarctica（南极洲念珠菌）脂肪酶B后，70的半衰期由18min提高到168min。,.,小分子修饰法小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、脂肪酸等与脂肪酶表面暴露的游离羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等基团反应，从而改变脂肪酶的酶学性质。 利用脂肪酸修饰C. viscosum（染色粘性菌 ）脂肪酶，该酶的酯交换活性从0 mmol/(hg)提高到270mmol/(hg)。,.,.,脂肪酶的分子进化,分子进化是在分子水平上应用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的设计或定向加工，以提高脂肪酶的活
