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1、分子生物学实验Experiments of molecular biology,一、 教学目的 分子生物学实验课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，从DNA的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了一系列基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的实验课程教学体系，包括现代分子生物学基本技术方法，帮助学生巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法、技术和操作技能。 二、 教学要求 通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解； 熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化,
2、定量, DNA克隆, 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术, 酶切技术, DNA片段回收,重组连接技术, 电泳技术, 转化技术, 基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术等； 要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理； 学习仪器设备的使用,分子生物学实验室要求,穿实验服进入实验室； 保持实验室安静； 保持实验室清洁干净和实验台面整洁； 实验前要预习实验教材； 不准穿拖鞋进入实验室； 不准在实验室吃东西、喝水； 要求刷卡进入实验室；,实验一核酸的提取（质粒DNA的提取和纯化）,【目的要求】 1学习载体的基本结构 2了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计思想； 3掌握碱裂解法提取质
3、粒的原理方法和各项基本技术；,【实验原理】,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SD
4、S复合物等一起沉淀下来而被除去。,【实验步骤】 1. Pick single colony and inoculate 5 ml of LB broth containing 200 g/l Ampicillin or 1mg/5ml with a loosened cap and a piece of tape to hold it in place. Shake at 250 RPM 37oC overnight. 2. Centrifuge 1.5mL cells in 1.5 mL Eppendorf tube at top speed for 1 minute. Discard su
5、pernatant. 3. Resuspend cell pellet in 100 ul of GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Vortex gently if necessary. 4. Add 100 ul of NaOH and SDS lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) respectively. Invert tube 6-8 times. 5. IMMEDIATELY add 150 ul of 5 M potassium acetate solution
6、 (pH 4.8). This solution neutralizes NaOH in the previous lysis step while precipitating the genomic DNA and SDS in an insoluble white precipitate. Spin at top speed 1 min.,6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up any white flakes. Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of
7、 isopropanol on ice for 10 minutes and centrifuge at top speed for 1 minute. 7. Aspirate off all the isopropanol supernatant. Dissolve the pellet in 0.4 ml of TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Add 10ul of RNAse A solution (20 mg/ml stock stored at -20 C), vortex and incubate at 37 C for
8、20 to 30 minutes to digest remaining RNA. 8. Extract proteins from the plasmid DNA using phenol/chloroform/ isoamyl alcohol (PCIA) by adding about 0.4 ml. Vortex vigorously for 30 seconds. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. Note organic PCIA layer will be at the bottom of th
9、e tube. 9. Remove upper aqueous layer containing the plasmid DNA carefully avoiding the white precipitated protein layer above the PCIA layer, transferring to a clean 1.5 ml eppendorf tube.,10. Repeat 9 step again. 11. Add 1 ml of absolute ethanol to precipitate the plasmid DNA and 50 ml of 3 M Sodi
10、un acetate solution on ice for 10 minutes. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. 12. Discard ethanol solution and resuspend DNA pellet in 50ul of TE buffer. 13. Dissolve 5uL in 995ul of water, and spec (blank spectrophotometer to water). The absorbance at 260 nm multiplied by t
11、en is the concentration of the DNA in units of mg/ml for a 1 cm pathlength cuvette (i.e. 50 mg/ml/OD 260nm). 14.Store it at -20 C.,核酸的分离与纯化,不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,核酸的种类： 真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞器DNA为双链环状分子； 原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子； RNA分
12、子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3端带有ploy(A)结构;tRNA 的三叶草结构。 病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。,一、核酸分离提取的原则,分离纯化核酸总的原则 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染，保证较高纯度。,3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行；,减少物
13、理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。 防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。,其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。 而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。,提取高质量基因组DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于Southern blot 杂交分析,二、真核细胞染色体DNA的制备
14、,真核细胞染色体DNA的制备过程,1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可导致DNA链的断裂。 （2）为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。,2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构建基因组文库。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体DNA。,3.DNA沉淀：一般采用2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（0.6） 4.DNA溶解：一般采用T
15、E,三、RNA的分离与纯化 -真核细胞RNA的制备,从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northern blot及cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于RNA的质量。,RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA总量的8085)、tRNA和核内小分子RNA(占10-15)、mRNA(占15)。 rRNA在总RNA分子中含量最丰富，由28S、18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大，分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。,mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大
16、多数mRNA分子(除血红蛋白及有些组蛋白mRNA以外)，均在3端存在20-250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。,鉴定所提取总RNA分子的质量，可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得28S、18S条带来判断。,Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma reesei induced by different inducers 图1. 木霉总RNA的分离 1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉,RNA 分离的关键因素是尽量减少RNA酶的污染！,如何创造一个无RNase的环境 ？ 极力避免外源RNase的污染：主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂 尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源于样品中的组织细胞。,(1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整个操作过程中，应戴口罩和手套。 (2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，也是
