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1、DB51四川省地方标准DB 51/T实验用猪 微生物学和寄生虫学等级划分及监测Experimental pigStandards and monitoring for microbiology and parasitology（征求意见稿）-发布-实施四川省市场监督管理局发布附件2.1DB 51/T 目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义24微生物学和寄生虫学等级分类25检测要求26检测程序47检测规则58结果判定69结论与报告6附录A（资料性附录）猪圆环病毒2型ELISA抗体监测7前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由四川省科学技术厅提出并归口。本标准由
2、四川省农村科技发展中心组织起草。本标准起草单位：四川省农村科技发展中心、四川农业大学、四川省疾病预防控制中心、成都华西海圻医药科技有限公司。本标准主要起草人：王敬东、邹弈星、陈正礼、刘科亮、陈兵、刘丽达、谢晓婕、兰青。实验用猪 微生物学和寄生虫学等级划分及监测1 范围本标准规定了实验用猪微生物学和寄生虫学等级分类、检测要求、检测程序、检测规则、结果判定和判定结论等。本标准适用于实验用猪微生物学和寄生虫学等级划分及监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB
3、/T 14926.8 实验动物支原体检测方法GB/T 14926.46 实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T 16551 猪瘟诊断技术GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GB/T 18448.1 实验动物 体外寄生虫检测方法GB/T 18448.2 实验动物 弓形虫检测方法GB/T 18448.6 实验动物 蠕虫检测方法GB/T 18448.10 实验动物 肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法GB/T 18638 流行性乙型脑炎病毒诊断技术GB/T 18641 伪狂犬病诊断技术GB/T 18642 猪旋毛虫病诊断技术GB/T 18644 猪囊尾蚴病诊断技术GB/T 18646 动物布鲁氏菌病诊
4、断技术GB/T 18647 动物球虫病诊断技术GB/T 18648-2002 非洲猪瘟诊断技术标准GB/T 18935 口蹄疫诊断技术GB/T 19200 猪水泡病诊断技术GB/T 19915.7 猪链球菌2型荧光PCR检测方法GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法GB/T 27521 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法NY/T 537 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法NY/T 548 猪传染性胃肠炎诊断技术NY/T 550 动物和动物产品沙门氏菌检测方法NY/T 564 猪巴氏杆菌病诊断技术NY/T 1953 猪附红细胞体病诊断技术规范NY
5、/T 1949 隐孢子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法NY/T 2417 副猪嗜血杆菌PCR检测方法SN/T 1919 猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用猪 Experimental pig经人工饲育，对其携带病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检验检测以及其他科学实验的猪。3.2普通级实验用猪Conventional experimental pig不携带所规定的人兽共患病病原及寄生虫和猪烈性传染病病原的实验用猪。3.3无特定病原体级实验用猪 Specific pathogen free(SPF
6、) experimental pig除普通级应排除的病原和寄生虫外，不携带所规定的潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原微生物及寄生虫的实验用猪。4 微生物学和寄生虫学等级分类检测要求实验用猪根据微生物学和寄生虫学等级控制要求划分为普通级猪和无特定病原体级猪。5 检测要求5.1 临床观察动物外观检查应无异常。5.2 检测项目及方法5.2.1 病原微生物检测项目各等级实验用猪病原微生物检测项目见表1。表1 实验用猪病原微生物检测项目及方法检测项目检测方法检测要求普通级无特定病原体级猪瘟病毒GB 16551口蹄疫病毒GB/T 18935猪繁殖与呼吸综合征病毒GB/T 18090日本乙型脑炎病毒
7、GB/T 18638布鲁氏菌GB/T 18646非洲猪瘟病毒GB/T 18648-2002猪链球菌2型GB/T 19915.7肺炎支原体GB/T 14926.8钩端螺旋体GB/T 14926.46伪狂犬病病毒GB/T 18641猪细小病毒SN/T 1919猪圆环病毒 2 型GB/T 21674；附录 A猪传染性胃肠炎病毒NY/T 548猪胸膜肺炎放线杆菌NY/T 537猪水泡病病毒GB/T 19200多杀巴氏杆菌NY/T 564副猪嗜血杆菌NY/T 2417沙门氏菌NY/T 550猪流感病毒GB/T 27521猪附红细胞体NY/T 1953注1： 必须检测，要求免疫；必须检测，要求阴性；必要时
8、检测，要求阴性；不需检测。注2： 必要时检测项目是指申请生产许可证、从国外引进实验用猪和疑有该病原体感染时必须增加检测的项目。5.2.2 寄生虫检测项目及方法各等级实验用猪寄生虫检测项目见表2。表2 实验用猪寄生虫检测项目及方法检测项目检测方法检测要求普通级无特定病原体级体外寄生虫GB/T 18448.1弓形虫GB/T 18448.2旋毛虫GB/T 18642囊尾蚴GB/T 18644猪球虫GB/T 18647隐孢子虫NY/T 1949结肠小袋纤毛虫GB/T 18448.10鼠贾第鞭毛虫GB/T 18448.10其它蠕虫GB/T 18448.6注1： 必须检测，要求阴性；不需检测。注2： 体外
9、寄生虫主要排除猪疥螨、猪虱、猪蠕形螨等；其它蠕虫主要排除猪蛔虫、食道口线虫（结节虫）、猪冠尾线虫（肾虫）、猪毛尾线虫（鞭虫）、布氏姜片吸虫、猪伪裸头绦虫、猪棘头虫、猪后圆线虫（肺线虫）、猪胃圆线虫、猪胃线虫等。6 检测程序检测程序见图1。动物检测报告编号外观检查麻醉a取血耳后或背部毛发、皮屑检测新鲜粪便，解剖（脏器、肠内容物）a，拭子（鼻、咽、肛门）b等微生物：检查病毒抗体、抗原和核酸寄生虫：弓形虫等微生物：真菌寄生虫：体外寄生虫微生物：细菌寄生虫：体内寄生虫注：a 寄生虫检测时需要；b 微生物检测时需要图1 微生物和寄生虫检测程序7 检测规则7.1 检测频率必须检测的项目6个月一次。7.2
10、抽样7.2.1 方式及数量选择6月龄以上的实验用猪用于检测，随机抽样。抽样数量见表3。表3 实验用猪抽样数量表群体大小（头）采样数量（头）100应不少于5头100500应不少于10头500应不少于20头7.2.2 方法7.2.2.1 可按病原微生物、寄生虫检测要求联合采样。7.2.2.2 采样方法按照NY/T 541进行。7.3 样本要求样本应有明显标识，写明检品名称、品种、品系、等级、数量及检测项目等内容，安全送达实验室。8 结果判定8.1 抗体检查8.1.1 病原微生物结果判定免疫项目，群体免疫合格率70%，判为合格。8.1.2 寄生虫结果判定血清抗体阴性判为合格。8.2 病原微生物抗原和
11、核酸检查未见阳性结果，判为合格。8.3 寄生虫虫体、虫卵检查虫体和虫卵均未检出，判为合格。9 结论与报告9.1 结论在检测的各等级实验用猪中，如有任一指标不符合该等级猪的微生物和寄生虫指标要求，应判定实验用猪不符合该等级标准要求。9.2 报告根据检测结果出具检测报告。附录A （资料性附录）猪圆环病毒2型ELISA抗体监测A.1采用猪圆环病毒2型ORF2合成肽抗原包被微孔板，加入稀释的待检血清，经温育后，若样品中含有特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后，加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶标二抗，在孔中加入TMB底物液，与
12、酶反应产生蓝色产物，加入HF溶液终止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。如采用商品试剂盒，则按说明书程序进行操作。A.2 样品采集A.2.1 样品类型猪血清。A.2.2 样品采集无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血3mL5mL，置于试管中，分离血清，待检。A.3 操作步骤A.3.1 用样品稀释液将待检样品40倍稀释后加入预包被的抗原板孔中，每孔加100L。阴、阳性对照各设2孔，每孔100L。另设一空白对照孔，空白对照孔加100L稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育30min。A.3.2 甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，300L/孔，每次静置3min后倒掉，最后一次
13、洗涤后在干净吸水纸上拍干。A.3.3 每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100L，置37温育30min。A.3.4 洗涤3次，方法同A.3.2。A.3.5 每孔加底物A液、B液各50L，混匀，室温避光显色10min。A.3.6 每孔加终止液50L，10min内测定结果。A.4 结果判定A.4.1 肉眼判定“+”深度蓝色，液体不透明；“+”蓝色，液体微透明；“+”中度蓝色，液体透光；“+”浅蓝色，液体透明；“”无色，液体完全透明。以显色“+”以上判为阳性。A.4.2 酶标仪判定A.4.2.1以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值0.6，阴性对照孔平均OD630值0.2。A.4.2.2样品OD630值0.42，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD630值0.38，判为阴性。_
