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1、串联质谱技术新生儿遗传代谢病筛查,上海市儿童医院 田国力,遗传代谢病,遗传性代谢病（Inborn Errors of Metabolism, IEM） 是由于基因改变导致某些酶或蛋白质功能发生质/量的改变，引起某些代谢途径上的生化物质发生改变引起一系列疾病。 大多数为单基因遗传病 遗传方式以常染色体隐性遗传或X连锁隐性遗传为主,遗传代谢病发病机制,酶,疾病特点,目前已发现500余种疾病 主要类型有氨基酸代谢障碍、有机酸血症、脂肪酸代谢障碍、核酸代谢异常症、金属代谢障碍、线粒体病 80%属常染色体隐性遗传 单病发生率低，群体患病率高 单基因缺陷所致代谢通路阻,大多为单基因遗传病，少数为线粒体基因
2、遗传病 表现非特异性，有赖遗传学或生化方法确诊，代谢物、酶学和分子检测 常规试验检测：缺乏特异标志物 儿科、血液科、神经科、骨科等不同诊室就诊 早期症状多无特异性，累及部位和病情轻重差异很大，极易造成误诊 新生儿期、幼儿或儿童期发病,某些可至成人期开始发病。,临床特征,多在新生儿期、幼儿或儿童期发病。某些可至成人期开始发病。 新生儿期发病：呕吐、喂奶困难、反应力低下、呼吸暂停、急促等 儿童期发病：可表现为全身多器官受累 以神经肌肉系统、呼吸系统、消化系统等症状为主 乏力、智力发育迟缓、肌张力增高或降低、癫痫、黄疸、肝脾肿大、呼吸困难 代谢性酸中毒、容貌异常、毛发皮肤色素改变、特殊体味 饮食、应
3、激反应、体能消耗等为疾病急性发作诱因。,遗传代谢病诊断困难,临床症状和体征：缺乏特异性 常规检测：缺乏特异标志物 特殊试验检测 氨基酸分析：氨基酸自动分析仪，高效液相色谱 酰基肉碱分析 串联质谱技术 气相质谱技术 酶学分析 基因诊断 组织活检、成纤维细胞组织培养、脑脊液培养、其他神经病学检查,PKU历史,体内高Phe引起患儿智力低下 1930提出低苯丙氨酸饮食治疗 1950应用饮食治疗 仅对PKU同胞有益 大多患儿出现不可逆症状后才确诊 1963年美国新生儿PKU筛查,Pediatrics, 105:89, 2000.,重视遗传代谢病筛查与诊断,疾病谱的改变 感染性疾病、重度营养不良、肿瘤、先
4、天畸形、遗传代谢性疾病 诊断技术的进步 生化检测、基因芯片、全基因组测序等 治疗方法的提高 替代治疗、系谱分析、遗传咨询、器官移植、基因治疗 国内外对出生缺陷的重视,新生儿遗传代谢病筛查,对新生儿遗传代谢缺陷、先天性内分泌异常以及某些严重的遗传性疾病进行筛查的总称 患病新生儿在临床症状出现前能给予治疗，防止或减轻体格和智力发育障碍，避免痴呆或死亡的发生 是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施,是集筛查、早期诊断、及时治疗、预防再发等措施为一体 减少出生缺陷，提高人口素质 是当今国际上早期发现遗传代谢病患儿的有效措施 预防效果显著，成本效益最好,新生儿遗传代谢病筛查,新生儿遗传代谢病筛查技
5、术,细菌抑制法:BIA 荧光法：FIA, EFIA 免疫法：ELISA, DELFIA 串联质谱仪：一次检测，多种疾病。检测氨基酸代谢异常，脂肪酸代谢异常和有机酸代谢异常。 Microarray platform：分子基因的研究，将DNA点在玻璃芯片上，然后与荧光标记的诊断探针反应，检测响应荧光信号 数字微流体(Digital Microfluidics):用于溶酶体贮积病的筛查,串联质谱筛查的优势,一种疾病一种测试 多种疾病多种测试 新生儿筛查方案的扩展 将非常昂贵,一份血样同时检测超过30多种物质，近40种 代谢疾病。 高灵敏性、高选择性 快速检测，达到早诊断、早治疗的效果 降低了筛查诊断
6、的假阳性和假阴性,VS.,传统筛查,串联质谱,MS/MS是一种在同一样本中同时测量多种待测物的方法 在同个测试平台上检测多个疾病就变得可能,质谱仪组成,MS仪主要由离子源、真空接口、质量分析器、检测器等四部分组成 样品中被测物质在离子源内电离形成各种质荷比不同带电离子（离子化），经真空接口进入由电场或磁场形成的质量分析器，利用电磁学原理，根据m/z不同将带电离子分开，最后到达检测器被检测，得到样品的质谱图及离子强度,质谱的基本原理,将分析物离子化为各种质荷比(m/z)不同的带电粒子 应用电磁学原理, 带电粒子按m/z在空间或时间上产生分离排列成的图谱 根据它们所形成的谱图、离子峰强度对分析物进
7、行鉴定 若同时加入被检测物质对应的内标或外标，既可以进行定量检测。,MS/MS的基本原理,两个MS经碰撞室(CID)串联而成 最常应用于NBS的是三重四极杆，由两个MS经碰撞室(CID)串联而成 一级MS是功能类似于气相和液相色谱的分离器，只允许选择的离子(母离子)通过 母离子进人CID产生碎片(子离子) 子离子经二级MS选择最终进入检测器 通过不同扫描的方式记录即可得到串联质谱图谱，实现对待测物的定性 通过样品中加入定量同位素内标，实现待测物定量检测,串联质谱仪,串联质谱技术设备,串联质谱新生儿筛查的基本原理,遗传代谢病：由于遗传因素体内正常代谢途径受阻 氨基酸代谢病患者血中氨基酸水平异常
8、有机酸血症及脂肪酸代谢障碍病患者血中游离肉碱或不同种类的酰基肉碱水平异常 利用串联质谱仪通过检测检测滤纸干血片中氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断多种遗传代谢病 一个测试平台上同时检测多个疾病,串联质谱新生儿筛查的步骤,采血后滴于专用采血滤纸片，晾干，制成滤纸干血片 采用串联质谱技术，通过同位素内标法(IS) 分析物和对应内标的响应比等比于分析物和对应内标的浓度比 一次性定量检测新生儿的滤纸干血片样品中的数十种氨基酸、酰基肉碱浓度 通过一系列规则来评估结果将化合物浓度和代谢疾病关联起来，综合判断30余种遗传代谢病,衍生化氨基酸扫描
9、质谱图,串联质谱检测指标,串联质谱检测指标,高苯丙氨酸血症,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症,游离肉碱及酰基肉碱,有机酸血症相关： C0、C2、C3、3DC、C4、C4-OH、C5、C5-OH、C5DC、C5:1 脂肪酸代谢病有关： C0、C4、C5DC、C6、C8、C10、C12、C14、C14:1、C16、C16-OH、C18、C18-OH,标本前处理方式,衍生化标本前处理方法,样品处理过程中加入盐酸正丁醇，引入丁基 改变分子结构（除去羧酸功能团），消除潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率 酯化作用可以减少潜在的溶剂或其他干扰物质 降低分析物极性更好的去溶剂化，样品更加容易进入仪器真空环境
10、酯化作用可以引入测量酰基肉碱和氨基酸方式（游离酸形式）无法检测到的干扰物,非衍生化标本前处理方法,无需使用盐酸正丁醇，使用甲醇萃取后可直接进样 整个样本预处理步骤仅需半小时， 琥珀酰丙酮的测试无需单独处理 具有扩展性：类固醇疾病、维生素缺乏等多种临床疾病 二羧酸酰基肉碱或氨基酸可能有两个负电荷位置，影响正离子效率 （分子的pKa值、流动相的pH值）,非衍生化法为应用趋势,发达国家的遗传代谢病筛查已从传统衍生化法逐步转为非衍生化法（近5年美国12.20%46.84%）,标本前处理方法比较,衍生化,实验步骤长 实验过程2.5小时左右 需要氮吹设备 丁醇盐酸具有强烈腐蚀性 对实验室环境要求高 实验人
11、员需防护 试剂相对便宜,非衍生化,简化实验过程 实验过程1小时 无需氮吹及衍生化过程 环境好 人员无需特殊防护 试剂价格相对贵,美国CDC统计,Phe测定标本数为例,检测指标选择,不同酶缺陷引起不同代谢途径差异 引起特定指标升高或降低 氨基酸代谢病可有一种或数种氨基酸水平异常 有机酸血症或脂肪酸氧化代谢病可有一种或数种酰基肉碱水平异常 一种指标异常可提示一种或几种代谢病 一种疾病也可对应多种指标异常 计算不同氨基酸或酰基肉碱之间的比值，有助于不同疾病之间的鉴别，降低假阳性率或假阴性率。,一个指标对应一种疾病,多个指标对应一种疾病：主要指标,一个指标对应多种疾病,一个指标对应多种疾病,疾病与临床
12、症状,新生儿筛查的首要代谢疾病,氨基酸类代谢病6 苯丙酮尿症 枫糖浆尿症 同型胱氨酸尿症 瓜氨酸血症 精氨酸琥珀酸血症 酪氨酸血症型,脂肪酸类代谢病5 中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 极长链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症 长链-3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏症 三功能蛋白缺乏症 肉碱摄取缺陷症,有机酸类代谢病9 异戊酸血症 戊二酸尿症型 3-羟基-3-甲基戊二酸尿症 多发性羧酶缺乏症 甲基丙二酸血症 甲基丙二酸血症(cbIA和cbIB) 三甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症 丙酸血症 酮硫解酶缺乏症,结果解释,静脉全肠外营养：氨基酸增多或支链氨基酸增高，氨基酸比率（苯丙氨酸/酪氨酸，甲硫氨酸/苯丙氨酸，亮氨酸/丙氨酸
13、）有助于区分真假阳性 药物：抗生素（氨苄青霉素和头孢噻肟、幼儿和母亲）酰基肉碱升高。C5 C14:1, C16:1OH 特殊饮食：含中链甘油三酯奶粉，低体重婴儿使用多，可能导致DBS中C6, C8, C10, 和 C12浓度升高 产妇疾病：幼儿样本的异常辨识未发病的产妇有代谢疾病。最常见的产妇疾病有CUD，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3MCC），3MGA，戊二酸血症型（GAI）和维生素B12缺乏症,结果解释,饥饿或肥胖：支链氨基酸升高 高蛋白饮食：总氨基酸、蛋氨酸、酪氨酸升高 肾脏疾病：苯丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、支链氨基酸等 临终：多种氨基酸升高，丙氨酸、谷氨酸显著升高 肝功能异常：长链脂肪酸升高 激烈运动：游离肉碱降低 窒息，昏迷，组织缺氧：长链脂肪酸升高,串联质谱技术发展方向,枫糖尿症：别异亮氨酸、异亮氨酸和羟脯氨酸分离 酪氨酸血症I型：琥珀酰丙酮 甲基丙二酸血症：甲基柠檬酸，3-羟基丙酸，甲基丙二酸 先天性肾上腺增生症-类固醇分析：皮质醇、雄烯二酮、17-羟基黄体酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇 溶酶体储存疾病：酶产品的功能分析,谢 谢！ ,
