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1、专题1 基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具一、 教学目标1.知识方面简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。2.情感态度与价值观方面认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。二、 教学重点和难点1.教学重点DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。2.教学难点基因工程载体需要具备的条件。三、教学方法讲授法，对话法四、教学课时2五、教学过程基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”来源作用问题1.什么叫磷酸二酯键？生思考讨论
2、回答，师提示3,5磷酸二酯键是核酸中核苷酸的连接方式，组成了核酸的一级结构。在核酸中一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称3,5磷酸二酯键。若干个核苷酸间以3,5磷酸二酯键（如下图）连接成的多核苷酸链为核酸。在链的一端的一个核苷酸，其核糖上第5位连接的磷酸只有一个酯键，称此核苷酸为DNA链的5磷酸末端或5端。另一端核苷酸上第3位的羟基是自由的，所以此核苷酸称为3羟基末端或3端。链内的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯键，第3位上的羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。图 DNA上的磷酸二酯键寻根问底12.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在
3、于原核生物中的作用是什么吗？生思考讨论回答，师提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。问题3.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？生思考讨论回答，师提示迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DN
4、A，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。结果黏性末端平末端问题4.限制酶所识别的序列有什么特点？生思考讨论回答，师提示限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如右图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。思考与探究1.限制酶在DNA的任何部位都能将
5、DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1) CTGCA (2) AC (3) GC （4） G (5)G (6) GC G TG CG CTTAA ACGTC CG(7) GT(8)AATTCCA G你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？生思考讨论回答，师提示答：任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质所决定的。2和7能连接形成ACGT 4和8能连接形成GAATTC TGCA； CTTAAG；3和6能连接形成GCGC 1和5能连接形成CTGCAG CGCG； GACGTC。二、DNA连接酶“分子缝合针”分类连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，
6、称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。作用这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。问题6.DNA连接酶连接的是什么部位？生思考讨论回答，师提示DNA连接酶是将一段DNA片段3端的羟基与另一DNA片段5端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。问题7. DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DN
7、A的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构
8、成的酶，但组成和性质各不相同。网上查询8.DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？生思考讨论回答，师提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。三、基因进入受体细胞的载体“分子运载车”旁栏思考题想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？生思考讨论回答，师提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等问题9.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？生思考讨论回答，师提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种
9、可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5
10、） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。模拟制作讨论题1. 你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？生思考讨论回答，师提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对。2. 如果你操作失误，碱基不能配对。可能是什么原因造成的？生思考讨论回答，师提示可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。1.2 基因工程的基本操作程序一、 教学目标1.知识方面简述基因工程原理及基本操作程序。2.能力方面尝试设计某一转基因生物的研制过程。二、 教学重点和难点1.教学重点基因工程基本操作
11、程序的四个步骤。2.教学难点（1）从基因文库中获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因。三、教学方法讲授法、对话法四、教学课时2五、教学过程对话先解决为什么要分四个步骤的问题，然后解决每一步骤的技术方法问题。1为什么要有“目的基因的获取”这一步？学生思考讨论回答，师提示引导学生看本专题题图中基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”可以说这既是概念，也是原理。这里所说的“更符合人们需要”，就是目的，那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能
12、赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。2为什么要有“表达载体的构建”这一步？学生思考讨论回答，师提示单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。课文中谈到构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。3.为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？学生思考讨论回答，师提示教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。4.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？学生思考讨论回答，师提示这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，
13、只有通过检测、鉴定才能得知。转折每一程序的有什么技术和方法的学习？ 一、目的基因的获取问题引入“目的基因的获取”有什么方法呢？求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？生思考讨论回答，师提示1970年，特明（H.M. Temin）和巴尔的摩（D. Baltimore）证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶，这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶，由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的，所以称为反转录酶（reverse transcriptase）。反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，
14、反转录酶也以53方向合成DNA（图1-3）。图1-3 由mRNA反转录形成cDNA的过程cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。讲授1.PCR的扩增过程是怎样的？PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至9095 ，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至5560 ，使两种引物分别与模板DNA链3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至7075 ，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着
