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1、 神经生物学实验讲义（供浙江大学本科生使用）主编 杜继曾 陈学群浙江大学 玉泉校区神经生物学和生理学教研室 编写者 牛晨颖 王世君 何俊俊 周淑鄢 丁学鹏 张 进同学2004年九月十六日精 要 速 览 系 列（影印版）Instant Notes Neuroscience（神 经 科 学）课堂讲授使用教材(英文）A. Longstaff 科学出版社和BIOS SCIENTIFIC PUBLISHERS LIMITED 2000脑内重要神经核团和神经生物学研究方法简介Methods for neuroscience research and nuclei in brain编写 牛晨颖1. 实验目的
2、理解神经核团的概念，解重要的神经核团；掌握脑立体定位图谱的使用方法；了解神经生物学研究的常用方法。2. 实验器材、试剂及实验材料手术刀、毛剪、注射器，1%戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)、依文氏蓝(Evans Blue)，小鼠。3. 实验步骤3.1 脑的大致结构和重要神经核团脑膜至外由内分别有：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜，其下是大脑皮层，边缘系统等结构。重要的核团有：PVN（室周核）、PeN（室旁核）、SON（视上核）、ME（正中隆起）、Hippocampus（海马）等。下表给出几个重要核团的大致范围，值得注意的是：核团在不同截面上的位置和形状是不同的，因此具体位置应查阅图谱
3、。距离前囟（mm）中心线两侧（mm）距脑背侧（mm）PVN（室周核）-1.0-4.20.00.85.05.5PeN（室旁核）0.0-3.20.00.56.59.5SON（视上核）0.0-1.81.02.38.58.8ME（正中隆起）-2.4-3.40.00.59.510.0Hippocampus（海马）-1.8-6.20.56.33.28.03.2 实验内容a) 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（40mg/kg）；b) 在颅骨前囟后35mm处打孔；c) 用微量注射器吸入3l依文氏蓝，注入小鼠背侧三脑室。d) 小鼠断头，除去颅骨，观察脑的结构。George Paxinos and Charles Wa
4、tson，The Rat Brain in Stereofaxic coordinates，Academic press，1986 4. 江湾型脑定位仪的使用6.1 脑立体定位仪的原理a) 脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。b) 直线式脑立体定位仪的设计原则c) 利用动物颅骨表面的某些解剖标志同脑表面及深部某一结构的相对恒定关系，从外部确定脑深部各结构的位置。d) 用立体空间直角坐标，以mm为单位，描述脑深部某结构所在的空间位置。e) 用一坚固的金属主框，加上杆、夹组成准确而对称的头夹。用一组有三维立体滑尺的电极移动架来导向，电极可准确地插入脑内某一指定结构。6.2 使用方法a) 装上耳
5、杆、上颌固定器、电极移动架，调整主框架至水平，测试两耳杆中心接触处是否在正中处。b) 装上架假电极，用假电极测定耳杆中心的高度,然后将电极移到门齿板上缘,调整门齿板比耳间线低5mm（该调整须根据图谱定，要与图谱中的方法保持一致）。c) 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（40mg/kg），将其固定在定位仪上。d) 按图谱确定核团的位置，在颅骨相应位置打孔。e) 按图谱在相应核团埋管。5. 神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。7.1 形态学方法神经生物学研究
6、中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。7.1.1 束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）
7、注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累 。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续45天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。7.1.2 免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，
8、成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧
9、光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成
10、抗原一抗标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大
11、而与多个酶分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近10年来又有新进展，如生物素亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量 68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素亲合素的应用大致有三种方法。标记亲合素生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与
12、二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。桥连亲合素生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。亲合素生物素过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素生物素过氧化物酶
13、复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。7.1.3 原位杂交法（in situ hybridization）原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。其基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片
14、段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA);依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究
15、细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。7.2 生理学方法神经生物学研究中的生理学方法有行为学方法、神经递质释放量的测定等，其中行为学方法最为常用。7.4.2 行为学方法行为学方法是建立在条件反射基础之上。条件反射是著名的俄国生理学家巴甫洛夫于20世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射基础上逐渐形成的。形成条件反射的基本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要多次强化外，还需要神经系统的正常活动。巴甫洛夫及其学派所研究的条件反射，称为经典性条件反射。另一种条件反射叫操作性(工具性)条件反射，美国心理学家斯金纳(BFskinner)把一只饿鼠放入实验箱内，当它偶然踩在杠杆上时，即喂食以强化这一动作，经多次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此基础上还可以进
