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1、实验三 脲酶的Km值简易测定,1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。,酶,是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。,酶的特征常数,Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度 酶促反应的特征常数只与酶的结构、底物和反应环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。,实 验 目 的,阐述酶促反应中特征常数的特点和意义； 说出利用比色法进行Km值测定的整个操作步骤； 思考Km值的测定对临床工作中的意义。,一 、原理,米曼氏方程（Michaelis-Menten
2、 equation）,V=,Vmax S,Km + S,米-曼氏方程解释： 当SKm时，v Vmax S /Km， 即v正比于S 当SKm时，v Vmax, 即S而v不变,Km值：当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是molL。 Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。,V,=,Km=S,=,底物浓度对酶促反应速度的影响,v Vm Vm 2,0 S,S与v关系： 当S很低时，S与v成比例- 一级反应 当S较高时，S与v不成比例 当S很高时，S，v不变-零级反应,Km值与 Vmax值测定,双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934） 1 = Km 1 + 1 V Vmax
3、S Vmax,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,酶促反应的原料,底物（脲液） 酶（脲酶液） 酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水等） 酶促反应发生的环境（碱性条件，加入NaOH；温度，37）,操作中每种试剂务必摇匀 煮沸脲液时注意试管口不能对人，变性脲酶液要煮沸变性彻底 试管一定要清洗干净，防止其他残留液体对实验的影响 各组试管加样注意一致性，防止人为加样造成的误差。重复测值，取平均数值,注意事项,实验操作,充分摇匀，静置5min，过滤，分别在滤液中加入以下试剂,迅速摇匀，用721型分光光度计，420nm，以对照调零，测定各管A值。,讨论小结,酶促反应有什么特点？ 测定酶促反应特征常数Km值有意义？,思考题：,1、脲酶的特征常数的特点是什么？ 2、测定Km值有什么意义？ 3、Km值的测定与临床疾病有何联系？,
