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1、第七章 植物花药和花粉培养,第一节 植物花药和花粉培养的概念和应用,一、花药和花粉培养的概念,花药：植物花的雄性器官，包括二倍性的组织和单倍性的雄性性细胞。,花粉：由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。,药壁和药隔组织 （2n） 花粉粒 （n）,花粉粒的形成：,指在合成培养基上，改变花粉的正常发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。,花药和花粉培养,该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。,花粉和花药培养的异同点：,共同点,培养目的相同： 均获得单倍体植株,花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。 花粉培养没有药壁组织干扰；可计
2、数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高，但技术更复杂。,不同点,缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。,二、花药和花粉培养的应用,（一）作物育种,ABaBAbab ABAABBAaBBAABbAaBb aBaABBaaBBaABbaaBb AbAabBAabBAAbbAabb abaAbBaabBaAbbaabb,2. 提高了目标基因型的选择效率,AaBb,AAbb,1/16,单倍体方法,3.诱变育种中的作用 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。,可探索亲本染色体组的构成。 分析单倍体植物减数分裂时，形成二价
3、体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。,（二）物种进化研究,（三）遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。 （四）构建连锁图谱 双单倍体群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。 （五）用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。,第二节 花粉小孢子发育途径,一、活体小孢子发育途径 花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要。 花粉母细胞（PMC）减数分裂形成四分体，释放4个小孢子。小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养核和生殖核；第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子。,花粉孢子体发育
4、途径（雄核发育）,二、离体小孢子发育途径 （一）雄核发育途径 最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。 1. A途径-小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞,（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉（或多核花粉）；生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。 （2）A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。,（3）A-VG途径（E途径） 花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合
5、，形成非单倍体植株。在获得的花粉植株群体中，有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株。,2. B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞（或游离核）。然后由这两细胞（或游离核）继续分裂形成单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。,小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径,（二）雄核发育启动机理 1. 雄核发育与P花粉的形成 胚性花粉粒特点： 核位于花粉粒中心； 醋酸洋红压片观察，花粉粒着色较浅； 有液泡和2个清晰着色的核。 P-花粉或E-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）。,2. 雄核发育与饥饿处理 对花粉进行短期的饥饿
6、处理，再供给发育所需营养，对花粉胚胎发生是非常重要的。,饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。其机制可能是使本来停止在G1期的营养核重新启动，开始DNA的复制和进一步发育。,三、花粉植株形态发生方式 花粉植株的形态发生途径： （一）胚状体发育途径 （直接发育途径） 小孢子经历合子胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 （二）愈伤组织发育途径（间接发育途径） 小孢子分裂数次形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。,三、花粉植株形态发生方式 体细胞胚：植物组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚（具胚根、胚芽、胚轴等结构
7、）非常相似的结构，称作体细胞胚或胚状体。 花粉胚：植物组织培养过程中，某些单倍体性细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，称作花粉胚或胚状体。,胚状体发育途径,烟草花药培养,部分花药通过胚状体途径形成小植株,胚状体发育途径,芸苔属小孢子培养,球形胚,鱼雷形胚,心形胚,辣椒小孢子胚胎形成过程（球形胚阶段后） a，b：球形胚，胚的表面粘连在花粉粒外壁上； c，d：心形胚；e，f：鱼雷形胚,愈伤组织发育途径,水稻花药培养,接种在平板上的水稻花药,部分花药产生愈伤组织,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,第三节 花药和花粉培养方法,一、花药培养 1. 取材 镜检，根据花粉的
8、发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2. 消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。,3. 培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。,二、花粉培养 (一)花粉的分离与纯化 1.自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2.挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。,3.机械游离 （1）磁搅拌法 用磁
9、力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； （2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4. 小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子,梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）,30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体）,(二)花粉培养方式 1.平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2.液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3.双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。,4.看护培养 利用花药或花药愈
10、伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5.微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。 6.条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。,看护培养图解,三、移栽驯化,四、白化苗现象,（一）白化苗产生的原因及机理 1.白化苗产生的原因： 内因：供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。 外因：预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 2.白化苗产生的机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外，无性系变异也可能是原因之一。,（二）白化苗的控制 通过对花粉
11、发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。,五、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 （一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。,芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较,（二）供体植株生长条件和生理状态 1.植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好，但物种间存在差异。 2.植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。 3.P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量 。,（三）花粉发育时期 小孢子发
12、育时期对诱导雄核发育非常重要。,一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。 形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。,处于不同发育时期的烟草小孢子,四分体: 醋酸洋红染色,单核期,双核期,四分体: Alexanders 染色,成熟花粉粒,不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期,花粉发育时期的确定,处于不同发育阶段的烟草花芽,对不同发育阶段的花药进行培养测试 确定最佳小孢子发育时期的形态特征 注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化,（四）预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子
13、从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。,预处理方法：,1.高低温处理 低温预处理：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接种。 应用较多。处理温度一般在1-14，时间从几小时至几十天不等；不同作物所用的预处理温度及时间差异较大；不同的处理温度需要不同的时间。,例子: 小麦穗子培养前4预处理几天，花药培养效率显著提高。 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降
14、为10.47个。,高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。 如烟草，32高温；小麦，33高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力。,2.化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。 甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。 3.其它 包括射线、离心、磁场等,1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。 如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署）。,（五）培养基,2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄
15、糖、果糖、海藻糖等。 不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖为最好的碳源。,3.激素 4.氨基酸 5.活性碳 6.pH,（六）培养条件,1.温度 物种间有差异 2.光照 3.植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。 5103到2104个/ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。,（七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。,第四节 单倍体植
16、株的二倍化,花粉植株的特点： 单倍体植株；植株弱小；高度不育。,一、倍性鉴定 1.染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。,2.间接鉴定 （1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。,（4）高/低温胁迫 50，10h为高温胁迫临界点；0，5h为低温胁迫临界点，进行此方法鉴定的倍性符合度为90%和80%。 （5）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （6）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）,二、染色体加倍,（一）茎段培养 将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的
